光笼控N-磷酸哌啶酮：选择性光裂解DPP8/9抑制剂的开发与应用

本刊推荐：本文报道了一种新型绿光裂解BODIPY光笼控二肽基肽酶8/9（DPP8/9）抑制剂，通过化学蛋白质组学手段验证其低光毒性、高效力和选择性。该研究为时空精确控制蛋白酶活性提供了新工具（ABPP技术），对研究细胞类型依赖性蛋白功能（如炎症、肿瘤发生）具有重要意义。

　　

引言

光笼控基团（Photocaging groups, PPGs）的引入已成为赋予化学抑制剂时空控制能力的重要策略。传统o-硝基苄基类光笼控基团需要紫外光激活，存在光毒性和组织穿透性差的局限。近年来开发的可见光（VIS）激活光笼控基团（如meso-甲基BODIPY）具有500-700 nm可调吸收特性，兼具低光毒性和膜渗透性优势。

二肽基肽酶8和9（DPP8/9）作为细胞内丝氨酸水解酶，通过切割底物N端倒数第二位脯氨酸键参与多种生物学过程。研究发现DPP9在炎症性细胞死亡（焦亡）、B细胞信号传导和DNA双链断裂修复中起关键作用，而DPP8功能相对局限。由于二者在特定细胞类型（如免疫细胞、癌细胞）中具有独特功能，开发能够实现复杂生物模型中细胞类型特异性抑制的工具显得尤为重要。

结果

化学合成与光解特性

研究团队基于先前发现的N-磷酸哌啶酮类共价DPP8/9抑制剂，通过将"Winter Green"硼-二甲基BODIPY光笼控基团连接到(S)-3-氨基哌啶-2-酮离去基团上，成功合成光笼控抑制剂5。液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示，50 μM的5在520-530 nm绿光照射下2分钟即可实现95%的光解效率，3分钟后完全解离（>99%），且仅产生活性抑制剂1和光解基团两种产物。

酶抑制活性分析

通过检测底物Gly-Pro-AMC中7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的释放，评估了5对DPP4/8/9的抑制能力。未光照时，5对DPP8和DPP9的表观IC₅₀分别为1,095±66 nM和24.7±6.8 μM；绿光照射后，抑制效力显著提升（DPP8：37±3 nM；DPP9：621±54 nM），增幅达30-40倍，而对DPP4无抑制活性。

动力学分析显示，光照条件下5与DPP8/9的共价结合效率（k_inact/K_I）分别为8,540 M^-1s^-1和737 M^-1s^-1，较黑暗条件下（223 M^-1s^-1和14 M^-1s^-1）提高38-51倍。

化学蛋白质组学验证

竞争性活性位点蛋白质分析（ABPP）实验表明，在HEK293细胞裂解液中，10 μM的5未光照时不影响丝氨酸水解酶探针（≡FP）或DPP8/9定向探针2的标记；光照后则特异性竞争分子量约100 kDa的DPP9条带（DPP8因表达量低未检测到），同时轻微抑制70 kDa的脯氨酰内切肽酶（PREP）标记——这与先前提到的N-磷酸哌啶酮探针2的脱靶特性一致。

活细胞ABPP实验进一步证实，5在细胞内同样能实现光控激活：20 μM浓度下光照5分钟可完全抑制DPP9标记，部分抑制PREP标记，表明该探针适用于活细胞层面的时空精确控制。

细胞水平靶标结合验证

细胞毒性实验显示，绿光照射本身对HEK293细胞无显著毒性。未光照时，即使高浓度（50 μM）的5也不影响细胞活力；光照后，25 μM和50 μM的5处理分别使细胞存活率降至65%和15%——与阳性对照1的效应相当，证实了光解后活性分子的靶标结合与功能发挥。

讨论

本研究成功开发了首例可见光激活的DPP8/9光笼控抑制剂，其独特之处在于将光笼控基团连接在抑制剂的离去基团上（而非直接阻碍活性位点结合），这种设计为光控蛋白酶抑制剂提供了新思路。

化学蛋白质组学技术（特别是竞争性ABPP）在光笼控探针表征中展现出重要价值：能够全面评估探针在光照前后的全蛋白质组水平效力和选择性，该方法值得在光控工具开发中推广应用。

该光笼控抑制剂在肿瘤研究领域具有应用潜力：DPP9表达与多种癌症预后相关（乳腺癌中高表达预示良好预后，其他肿瘤中则相反），且参与肿瘤生长、转移等过程。此外，DPP9在新生儿存活、记忆形成、DNA修复和线粒体稳态中的关键作用，也使得能够时空精确控制其活性的工具具有重要价值。

实验方法

化合物5通过BODIPY光笼控基团3转化为对硝基苯酚碳酸酯衍生物4后，与抑制剂1在温和碱性条件下耦合制备。光解实验采用50 μM探针溶液，520-530 nm绿光LED照射，LC-MS定量分析。

酶学检测使用10 nM人源DPP4/8/9，底物GP-AMC浓度250 μM，通过测量AMC荧光释放计算酶活。竞争性ABPP使用HEK293细胞裂解液或活细胞，探针浓度2-10 μM，通过点击化学连接Cy3-N₃进行荧光检测。

细胞毒性采用MTT法测定，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide浓度5 mg/mL，检测波长570 nm（参比630 nm）。所有实验均设三次技术重复，数据以均值±标准误表示。