基于化学遗传报告系统的双色时间戳基因表达监测技术及其在BiP/GRP78调控机制与药物筛选中的应用

本文开发了一种创新的化学遗传报告系统，通过将自标记蛋白HaloTag与内质网关键伴侣蛋白BiP/GRP78共表达，实现了对未折叠蛋白反应（UPRER）核心调控因子的动态监测。该系统采用双色时间戳标记策略，显著提升检测灵敏度，成功应用于活细胞成像、流式细胞术和高内涵筛选（HCS），并发现新型BiP/GRP78表达激活剂，为蛋白质错误折叠相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）的治疗策略提供新思路。

　　

引言

细胞内的基因表达调控对维持机体稳态至关重要。内质网中的未折叠蛋白反应（UPR^ER）在蛋白质折叠与加工稳态中发挥关键作用。本研究聚焦于重要分子伴侣蛋白BiP/GRP78（由HSPA5基因编码）的表达监测，该蛋白不仅是UPR^ER的核心调控因子，更与癌症、神经退行性疾病等多种病理过程密切相关。

化学遗传报告系统的设计原理

研究团队创新性地将自标记蛋白HaloTag通过内部核糖体进入位点（IRES）与BiP/GRP78实现共表达。该设计通过CRISPR/Cas9介导的精确染色体整合技术（CRIS-PITCh法），将IRES-HaloTag-T2A-PuroR序列嵌入HSPA5基因的3'-非翻译区（3'-UTR）。这种策略确保BiP/GRP78、HaloTag和嘌呤霉素抗性基因（PuroR）作为独立蛋白同时表达，既避免了融合蛋白对目标蛋白功能的干扰，又保留了内源启动子的天然调控环境。

报告细胞系的构建与验证

在HEK293细胞中成功构建HEK293-BiP-HT单克隆细胞系。通过Western blot证实了tunicamycin（Tm）处理后BiP/GRP78和HaloTag表达量的同步上调。RT-qPCR分析显示Tm处理后BiP/GRP78与HaloTag mRNA水平呈现同等倍数增长，全基因组测序（WGS）验证了单等位基因精准整合且无脱靶效应。

双色时间戳技术的突破性优势

针对基础表达水平高、细胞间异质性大的挑战，研究团队开发了创新的双色时间戳策略：首先使用MaP555氯烷染料标记基础表达水平的HaloTag，洗涤后通过SiR-Br染料标记诱导表达的新生蛋白。这种策略实现了三个重要突破：

1. 1.

   将检测动态范围从单色的7倍提升至31倍

2. 2.

   能够区分基础表达与诱导表达信号

3. 3.

   通过ATF6通路抑制剂PF-429242验证了信号通路特异性

   流式细胞术分析进一步证实该技术适用于单细胞水平的表达相关性研究。

高内涵筛选发现新型激活剂

应用该技术对7680种小分子化合物进行双轮筛选：首轮筛选发现320个潜在激活剂（激活分数≥0.4），次轮在PF-429242抑制剂存在下进行反筛选。通过比较两轮筛选的评分差异，最终鉴定出10个能特异性通过ATF6通路激活BiP/GRP78表达的新型化合物。其中化合物F2762-0399经RT-qPCR验证能引起BiP/GRP78和HaloTag mRNA两倍上调，且未见既往研究报道。

技术优势的量化验证

通过对比实验证实双色策略的显著优势：在首轮筛选中，双色法发现320个hit化合物，而传统单色法仅能检测到59个（18%）；在最终鉴定的10个先导化合物中，单色法只能识别2个。这表明双色时间戳技术对弱效激活剂的检测灵敏度具有压倒性优势。

结论与展望

该研究建立的化学遗传报告系统具有多重技术优势：

1. 1.

   保持内源基因调控的天然环境

2. 2.

   通过染料选择实现检测信号的灵活调控

3. 3.

   双色时间戳策略极大提升检测灵敏度

4. 4.

   兼容活细胞成像、流式细胞术和高内涵筛选等多种平台

   该系统不仅为BiP/GRP78调控机制研究提供强大工具，更为蛋白质错误折叠相关疾病的药物发现开辟了新途径。未来可通过调整靶向基因快速适配其他研究体系，在功能基因组学和精准医疗领域具有广阔应用前景。