自保存eDNA过滤器的现场测试及长期监测中方法变更时校准的重要性

本研究评估了自保存环境DNA（eDNA）过滤器与传统乙醇保存法在鲑科鱼类监测中的性能对比，通过野外试验证实了5.0μm聚醚砜（PES）膜自保存过滤器与乙醇保存法在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）eDNA检测率和DNA产量上无显著差异，同时揭示了流速、水温和物种丰度等环境协变量对eDNA产量的影响，为渔业eDNA监测项目的方法更新提供了关键校准依据。

　　

引言

水生环境DNA（eDNA）采样方法的优化对提高物种检测准确性至关重要。当前过滤法存在现场转移滤膜至保存容器的操作缺陷，而新兴的自保存过滤器可减少处理步骤，但需通过比较研究确保新方法的可移植性。本研究通过典型溪流渔业eDNA采样场景，评估了两种滤膜保存方法（自保存vs乙醇）的性能，并对比了原始监测协议（0.45μm硝酸纤维素膜+乙醇保存）的数据差异，强调了方法变更时校准的重要性。

研究方法

研究区域覆盖加拿大不列颠哥伦比亚省与美国华盛顿州的奥卡诺根河流域，重点监测洄游性虹鳟种群。采用三种采样方法：使用Smith-Root eDNA背包采样器的5.0μm PES膜自保存过滤器（PES-SP）、同规格乙醇保存过滤器（PES-EtOH），以及基于蠕动泵的0.45μm CN膜乙醇保存法（CN-EtOH）。每种方法在每个采样点收集三个重复样本，随机改变操作顺序。

样本处理遵循严格防污染流程：自保存过滤器直接封装于原包装，乙醇保存组需用无菌镊子转移滤膜至含1.7mL分子级乙醇的冻存管。所有样本在-20°C下运输保存。DNA提取使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit，并经Zymo OneStep PCR抑制剂去除试剂盒处理。通过物种特异性qPCR assay（Wilcox et al. 2015）检测虹鳟eDNA，并在反应体系中加入TaqMan内参（IPC）评估抑制情况。

数据分析采用R语言构建三类广义线性混合模型（GLMM）：针对检测率的二项分布模型、针对DNA产量的γ hurdle模型，以及针对扩增延迟（抑制指标）的γ hurdle模型。环境协变量包括水温（8-19°C）、流速（0.012-45.024 m³/s）和虹鳟丰度（0-63,981尾），数值预测因子均经过标准化处理。

研究结果

物种检测

三种方法的qPCR阳性率分别为PES-SP 89%、PES-EtOH 90%、CN-EtOH 79%。统计模型显示各方法间无显著差异（p>0.05），环境协变量对检测率也无显著影响。残差诊断表明模型拟合良好。

DNA产量

CN-EtOH组的DNA拷贝数最高（0-716拷贝，折合0-1433拷贝/L），PES组显著偏低（PES-SP: 0-334拷贝；PES-EtOH: 0-643拷贝）。在非零数据子集中，CN-EtOH法的DNA产量显著高于PES-SP法（p<0.001），而两种PES保存方式间无显著差异（p=0.082）。环境协变量分析显示：虹鳟丰度与过滤体积对DNA产量呈正相关（p<0.05），流速与水温呈负相关（p<0.01）。标准化后的DNA产量比较表明，CN-EtOH法的数据变异性（标准误）高于PES组。

扩增延迟

抑制现象发生率分别为PES-SP 38%、PES-EtOH 48%、CN-EtOH 3%。CN-EtOH法产生零延迟（无抑制）的概率显著高于PES组（p<0.001），但在非零延迟数据中，CN-EtOH组的延迟时间反而更长（p<0.01）。流速增加会显著提高零延迟概率（p<0.05），表明高流速可能稀释抑制剂浓度。

污染控制

两个PES-SP现场空白和一个CN-EtOH空白出现虹鳟DNA阳性，但提取空白和无模板对照均无污染，污染源未能明确判定。

数据校准

通过线性回归建立方法间DNA产量换算方程：CN-EtOH与PES-EtOH的R²=0.61，与PES-SP的R²=0.69，而两种PES保存方式间的相关性较弱（R²=0.41）。校准方程可为长期监测提供数据转换依据。

讨论

自保存过滤器展现了与传统乙醇保存法相当的效能，其免转移特性可降低污染风险并简化操作流程。DNA产量差异主要归因于滤膜孔径（5.0μm vs 0.45μm）而非保存方式——小孔径CN膜能捕获更小DNA片段，且其高蛋白结合效率（Liang and Keeley 2013）进一步提升捕获量。自保存过滤器的干燥过程可能导致少量DNA降解，但影响微弱。

抑制剂分布特征与过滤体积密切相关：PES组因过滤体积大（1.52-9.66L）而抑制剂富集量高，CN-EtOH组虽过滤体积固定（0.5L）但单位体积抑制剂捕获效率可能更高。环境协变量分析证实eDNA浓度受水文条件（流速稀释效应）和生物因素（物种丰度）共同调控，水温通过促进降解负向影响产量（Jo 2023）。

本研究凸显了方法更新时校准的必要性：尽管检测率无差异，但DNA定量结果需通过回归模型校正方可进行历时比较。建议渔业监测项目在切换方法前开展并行采样，建立方法间换算关系，尤其需关注滤膜材质（PES vs CN）、孔径尺寸和保存方式的综合影响。未来研究可探索自保存机制与其他滤膜（如CN膜）的组合优化，并深入解析抑制剂去除试剂盒对不同采样方法的差异化效应。