北方沿海区域穿叶眼子菜草甸——具致病特性及复杂碳代谢多样性细菌的储库

《Environmental Microbiology Reports》：Perfoliate Pondweed Meadows in Northern Coastal Areas—Reservoirs of Diverse Bacteria With Pathogenic Traits and Complex Carbon Metabolism

本研究发现北方波罗的海沿岸的穿叶眼子菜（Potamogeton perfoliatus）草甸是潜在致病菌（如弧菌属、军团菌属和钩端螺旋体属）的富集热点，同时其附生细菌群落展现出独特的芳香族和聚合物化合物降解的代谢功能（如假红杆菌属、新鞘氨醇杆菌属和赤杆菌属）。研究结合培养依赖法和16S rRNA宏条形码技术，揭示了大型植物叶片作为微生物过滤器及有机物降解平台的双重生态角色，对水生生态系统健康及碳循环具有重要启示。

　　

引言

大型植物草甸在浅水湖泊和沿海区域广泛分布，具有过滤从陆地进入水生系统营养物的功能。近年来，由于富营养化、土地利用和气候变化等环境变迁，大型植物多样性呈下降趋势，可能影响其生态功能。穿叶眼子菜（Potamogeton perfoliatus）作为淡水和亚北极沿海地区的常见大型植物，形成广阔的草甸，在维持生态系统功能和营养循环中扮演关键角色。草甸为众多生物提供栖息地，尤其在鱼类繁殖方面至关重要，同时其叶片、根和茎表面为微生物提供生长和代谢的理想环境，包括接触溶解有机碳（DOC）、氧气和宏量营养素。

大型植物与微生物之间存在紧密关系，某些根际细菌甚至具备降解芳香碳（如酚类）的能力，可用于环境修复。近期研究显示，大型植物上的细菌群落中变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度较高，且碳代谢功能相较于海水细菌更为富集。北方地区大量陆源有机质输入水体，导致高DOC浓度和腐殖芳香物质存在于湖泊、河流及沿海区域（如波罗的海北部），大型植物草甸作为广泛存在的生态系统，其附生微生物可能在降解陆源有机质中发挥重要作用。

另一方面，部分研究指出大型植物是细菌病原体的储库，如气单胞菌属（Aeromonas）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和弧菌属（Vibrio），但尚无共识。海草草甸被证明可减少周围海水中的潜在致病菌，从而降低人类和海洋生物疾病风险。因此，深入研究大型植物草甸在过滤病原体和降解有机化合物方面的功能，对理解其生态与健康意义至关重要。

材料与方法

采样与化学分析

研究在波罗的海北部（博滕海）的Rundvik湾和Kyl?ren湾进行，两地相距14公里，均有森林河流淡水输入。2022年8月（穿叶眼子菜生长旺季）采集海水和大型植物样本。每个海湾在草甸内、沿岸和离岸各采5个1升海水样本（深度0.5米），同时随机采集3株穿叶眼子菜叶片，存于含0.22微米过滤海水的50毫升离心管中。样本立即送实验室处理，通过剧烈摇晃1分钟以松散附着附生细菌。

营养盐分析包括DOC、总溶解磷（TDP）和总溶解氮（TDN）。海水经0.22微米滤膜预过滤，DOC样本用HCl酸化后使用Shimadzu TOC-5000分析仪测定，TDN和TDP经过硫酸盐氧化后使用QuAAtro39自动分析仪测定。采用Mann-Whitney U检验比较两海湾营养盐浓度差异。

细菌分类与功能分析

部分海水和所有植物样本经0.22微米滤膜过滤，存于DNA Shield中，-80°C保存直至DNA提取。使用ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit提取DNA，并通过Nanopore MinION Mk1C仪器进行16S rRNA扩增子测序（引物27F和1492R）。测序数据经质量过滤、长度选择（1.2–1.8 kb）和NGSpeciesID流程处理，获得一致性序列。通过BLASTn比对SILVA SSU v138.1数据库（identity ≥80%）进行物种注释，排除叶绿体和线粒体序列。

使用LEfSe分析识别大型植物叶片上显著富集的细菌属，并通过Pearson相关分析探索细菌属与环境变量的关系。基于PICRUSt2预测功能代谢通路，比较KEGG Orthology（KO）和MetaCyc途径的丰度。Alpha多样性（Shannon指数和物种丰富度）使用hillR包计算，Beta多样性通过Bray-Curtis距离进行NMDS和PERMANOVA分析。

潜在致病菌分离与鉴定

使用两种选择性培养基（Coliform ChromoSelect和TCBS）分离大肠菌群和弧菌属。100微升样本涂布平板，22°C培养3天后计数菌落形成单位（CFU），并挑取形态 distinct 菌落进行纯培养和16S rRNA基因Sanger测序。通过ANOVA和Tukey HSD检验比较CFU计数差异。

结果

理化变量

水温介于14–16°C，盐度<0.5至4 PSU。Rundvik湾沿岸DOC和TDN浓度较高，可能受L?gde河输入影响，TDP则在草甸和离岸区域较高。Kyl?ren湾各位置营养盐浓度相似。两湾间TDN浓度存在显著差异（Rundvik较高），但DOC无显著差异。

细菌群落结构

共鉴定21个细菌门，其中变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻门、疣微菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、Bdellovibrionota、Desulfobacterota和Armatimonadota为最优势类群。变形菌门在两种生境中均占主导（43%–74%），蓝藻门在植物上丰度更高（8%–12% vs. 海水2%–7%），放线菌门则在海水中更丰富（11%–18% vs. 植物1%–2%）。在属水平，假红杆菌属（Pseudorhodobacter）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、赤杆菌属（Erythrobacter）、Luteolibacter、Nioella、Lewinella和Rhodobacter在植物上显著富集，而CL500-29、Limnohabitans和Pseudarcicella在海水中富集。

Alpha多样性显示植物样本Shannon多样性更高，但物种丰富度无显著差异。NMDS和PERMANOVA表明细菌群落组成在植物与海水间差异显著（R²=0.632, p=0.001），但两湾间相似。

功能代谢预测

PICRUSt2分析揭示14条通路在植物与海水间存在显著差异。植物附生细菌中，细胞过程、运输与分解代谢、人类疾病、代谢、次级代谢产物生物合成、糖链生物合成和氨基酸代谢等相关基因家族更富集。MetaCyc途径分析显示，芳香化合物降解（如芳香物meta裂解、甲苯降解IV、硝基苯甲酸降解和儿茶酚降解）、CMP-legionaminate生物合成I和肠杆菌共同抗原（ECA）生物合成途径在附生群落中 enriched。碳水化合物代谢途径（如淀粉降解III、岩藻糖降解和蔗糖降解）也在植物上相对较高，而UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成I和半乳糖降解途径在海水中更丰富。

潜在致病菌发生

培养法显示植物样本中大肠菌群和弧菌属CFU更高（Rundvik湾植物平均2.3×10³ CFU/mL，Kyl?ren湾3.5×10³ CFU/mL）。Kyl?ren湾植物上大肠菌群显著高于沿岸和离岸海水。两湾间弧菌属CFU存在显著差异（Kyl?ren较高）。随机测序鉴定出Serratia和气单胞菌属。宏条形码数据发现钩端螺旋体属（Leptospira）和军团菌属（Legionella）在沿岸水域相对丰度较高，植物上钩端螺旋体属在Kyl?ren湾可达3.2%。

细菌属与环境变量关系

植物上假红杆菌属与TDP呈正相关。海水中Pseudarcicella和Pseudanabaena与DOC正相关，Flavimaricola与DOC负相关。

讨论

独特的植物与海水细菌群落

穿叶眼子菜叶片表面细菌群落与自由生活海水细菌显著不同，且Shannon多样性更高，可能与叶片提供的稳定微生境有关。变形菌门作为最优势门，其功能可能与植物凋落物降解相关。蓝藻门在植物上丰度较高，源于栖息地稳定性放线菌门在海水中占优，可能参与有机质降解。Rhodobacteraceae和Saprospiraceae为植物上最优势科，后者可能分解复杂有机碳。假红杆菌属、新鞘氨醇杆菌属和赤杆菌属等富集属具备降解持久性有机化合物、木质素和多环芳烃的能力，可能有助于周围环境中有机物的分解。

细菌与环境变量的关系

仅少数细菌属与环境变量显著相关。植物上假红杆菌属与TDP正相关，响应磷限制环境中的营养变化。海水中Pseudarcicella（寡营养淡水指标）与DOC正相关，可能间接受低盐度影响Pseudanabaena（蓝藻）与DOC正相关，可能在低氮条件下具竞争优势Flavimaricola与DOC负相关，可能偏好高盐条件。总体而言，营养盐可用性、DOC和盐度是影响附生和海水细菌发生的重要因素。

附生群落的复杂有机化合物代谢途径

功能预测显示植物附生细菌在芳香化合物降解途径上富集，如儿茶酚降解和β-酮己二酸途径，表明其具备分解芳香环结构化合物的能力。假红杆菌属、新鞘氨醇杆菌属和赤杆菌属可能在此过程中发挥关键作用。碳水化合物降解途径（如淀粉和岩藻糖）可能与植物源碳水化合物分解有关。ECA生物合成途径仅在植物上丰富，可能涉及肠杆菌目细胞膜合成，与大肠菌群存在相关。植物可能分泌特定次生代谢物（如酚类化合物），塑造专性细菌类群，形成共生关联。

穿叶眼子菜草甸——波罗的海北部沿海潜在致病菌储库

较高CFU表明穿叶眼子菜草甸是病原菌的储库和过滤器，可能减少海水中的病原菌浓度，降低疾病风险。检出的气单胞菌属和Serratia可能源自草甸中鱼类（如梭子鱼、斜齿鳊、鲈鱼和刺鱼）。这些病原菌可引致人类肠胃炎、尿路感染及鱼类疾病。培养法与宏条形码结果互补，后者还检出军团菌属和钩端螺旋体属，沿岸水域丰度较高，可能与腐殖物质输入有关。大型植物草甸作为病原菌热点，对未来新兴病原体传播和健康风险具有重要启示。

结论

穿叶眼子菜草甸是潜在致病菌的源库，其附生细菌群落在降解复杂有机碳化合物（可能源自植物残体和腐殖物质）中扮演重要角色。植物可能合成酚类等次生代谢物，支持特定附生细菌生长，形成共生关系。草甸中病原菌（如弧菌属、大肠菌群、军团菌属和钩端螺旋体属）的出现，与其作为水质指标的传统认知需重新评估。结合传统培养和分子技术可更全面监测病原菌，未来研究应聚焦于细菌群落的生态与健康整合框架，以及病原体扩散的动态机制。