Hnrnpl缺陷对发育中肌细胞转录模式的深远影响：从Notch信号通路异常到选择性剪接紊乱的机制探索

本研究通过纳米孔长读长转录组测序和qPCR分析，深入探讨了Hnrnpl缺失对肌细胞转录调控网络的多层次影响。文章揭示了Hnrnpl通过调控Notch信号通路关键基因（如Jag2、Notch2/3）和肌肉特异性基因（包括Mbnl1/2、Fhl1、Lamp2、Dtna等）的表达与剪接，在骨骼肌发育过程中发挥核心作用。研究发现Hnrnpl缺失导致肌管融合指数显著降低，并诱发线粒体功能障碍和细胞凋亡途径激活。研究还通过果蝇平滑基因（smooth）敲低实验验证了这种调控机制的进化保守性。该研究不仅阐明了hnRNP L在肌肉发育中的关键作用，还为肌肉疾病（如肌强直性营养不良）的机制研究提供了新的分子视角。

　　

Abstract

异质性核核糖核蛋白（hnRNPs）作为RNA结合蛋白超家族，在基因表达和剪接调控中发挥关键作用。本研究聚焦hnRNP L在肌肉发育过程中的功能，通过纳米孔长读长转录组测序和qPCR技术，系统分析了^Hnrnpl敲低对C2C12肌细胞转录模式的影响。

引言：hnRNPs与肌肉发育的密切关联

hnRNPs家族蛋白与多种疾病相关，包括癌症、肌萎缩侧索硬化（ALS）、阿尔茨海默病、脊髓性肌萎缩（SMA）和罕见神经发育障碍。在肌肉发育领域，多个hnRNPs成员被证实参与调控过程：hnRNP A1调控肌肉发育相关基因（如^MEF2C）的剪接；hnRNP D（AUF1）促进^MEF2C翻译；hnRNP A2/B1通过调控MBNL1、MBNL2和RBFox2等RNA结合蛋白的剪接来控制肌肉分化。值得注意的是，^HNRNPA1或^HNRNPDL突变可导致人类肌营养不良。

hnRNP L通过与肌肉特异性长链非编码RNA lncFAM结合形成复合物，结合^MYBPC2启动子促进其转录，从而促进肌生成。研究表明hnRNP L在^JAG2 mRNA（编码典型Notch配体）以及其他Notch信号通路关键伙伴（如^NOTCH2、^NOTCH3、^POGLUT1和^NUMB）上存在结合位点。这种调控功能在物种间高度保守：果蝇hnRNP L直系同源基因^smooth突变导致肌肉变性和胸肌缺陷；斑马鱼^Hnrnpl2敲低引起严重肌肉异常；小鼠^Hnrnpl完全敲除导致胚胎致死性。

材料与方法

研究使用C2C12肌细胞系，通过shRNA介导的基因敲低技术降低^Hnrnpl表达。使用三种不同的shRNA靶向小鼠^Hnrnpl序列，并建立稳定敲低细胞系。通过细胞计数评估增殖能力，免疫荧光染色计算肌管融合指数。

转录组分析采用纳米孔直接RNA测序技术（SQK-RNA002），使用R9.4.1流动槽和GridION测序仪。数据分析包括使用^guppy进行碱基识别，^minimap2比对到小鼠基因组（GRCm39），^htseq进行基因转录本计数，^nanocount估计特定转录变体。差异表达分析使用^deseq2，剪接分析采用^{isoformswitchanalyzer}和^dexseq。

果蝇实验中，使用多种Gal4驱动系（包括^Mef2Gal4）在特定发育阶段敲低^smooth基因，并通过qPCR分析基因表达变化。

结果

Hnrnpl敲低效率与表型验证

shRNA介导的^Hnrnpl敲低在肌细胞中达到约50%的效率，在分化的肌管中效率提高至约70%。敲低不影响细胞增殖，但显著降低肌管融合指数，这与先前在人原代肌细胞中的研究结果一致。

Notch信号通路基因的广泛下调

Notch通路基因表达分析显示，在肌细胞阶段有19个Notch通路基因显著下调，在肌管阶段有41个基因显著下调（不包括^Hnrnpl本身）。纳米孔测序与qPCR结果的Pearson相关系数为0.5215，但由于许多Notch基因在测序中覆盖度较低（41/96个基因baseMean<10），qPCR对低表达基因的检测更为敏感。

差异基因表达全景图

主成分分析显示对照组和敲低组明显分离。Wald检验结合局部离散度拟合检测到80个基因显著上调和148个基因显著下调。最上调基因为^Mgl2（log₂FC=7.9），最下调基因为^Stmn2（log₂FC=-10）。

通路富集分析显示，上调基因富集于凋亡调控和细胞迁移调控通路；下调基因富集于肌细胞骨架、肌肉收缩、神经元投射发育调控、胶原生物合成调控、凋亡通路负调控和通过剪接体的选择性剪接调控等通路。氧化应激反应和伤口愈合在上下调基因中均有出现。

剪接因子表达变化

^Mbnl2显著下调，^Mbnl1虽log₂FC未达0.5阈值但经P值调整后显著上调。qPCR验证了^Mbnl1（平均FC=1.3）和^Mbnl2（平均FC=0.4）的变化。其他hnRNP基因（包括^Hnrnpll）表达无显著变化。

选择性剪接事件的精细调控

剪接分析发现多个基因存在显著剪接变化：

^Lamp2：转录变体1（NM_001017959.2）下调而变体2（NM_010685.4）上调。对照组中变体1和变体2比例约为45%:55%，敲低组变为20%:80%。PCR和qPCR均验证了这一变化。

^Fhl1：三种主要异构体（KyoT1、KyoT2、KyoT3）均下调，但KyoT3编码转录本下调程度显著大于KyoT1和KyoT2。KyoT2和KyoT3均含有RBP-J结合基序，是Notch信号通路的共抑制因子。

^Dtna：虽未通过计算分析检测到，但手动检查发现转录变体3/X35（编码α-DB1异构体）下调而预测变体X39（编码α-DB3异构体）上调。对照组中约13%读段映射到变体3/X5起始外显子，敲低组中无读段映射；预测变体X39映射读段从5%增至25%。

果蝇模型中的保守性验证

果蝇^smooth基因 ubiquitous 敲低导致致死性，中胚层特异性敲低（使用^How-Gal4）也导致致死，表明该基因对肌肉发育至关重要。使用^Mef2Gal4驱动系可获得一定数量的敲低成虫，这些果蝇表现出与年龄相关的"下垂翼"表型，提示肌肉无力。

qPCR分析显示，6日龄时^Limpet（^Fhl1/2直系同源物）上调；20日龄时所有检测基因（除^smooth外）均显著上调；30日龄时^rumi和^Notch转为下调；50日龄时^misfire也转为下调。

讨论

本研究揭示了hnRNP L在肌肉发育中的多层次调控作用：

剪接因子网络的交互调控

^Mbnl2下调和^Mbnl1上调特别值得关注，因为这两个剪接因子与肌强直性营养不良1型（DM1）密切相关。hnRNP L与MBNL1已知为结合伙伴，^Mbnl2缺失可能加剧^Hnrnpl敲低介导的异常基因剪接。

神经肌肉连接的潜在影响

最下调基因^Stmn2是运动和感觉神经元生长修复的重要调节因子，其缺失导致神经肌肉接头去神经支配。下调基因富集于神经元投射发育和树突形态发生通路，提示^Hnrnpl缺失可能影响肌肉神经支配。

自噬与线粒体功能紊乱

^Lamp2剪接变化具有重要功能意义：变体1（LAMP2A）是分子伴侣介导的自噬（CMA）受体，其下调可能减少CMA；变体2（LAMP2B）促进自噬融合，其上调可能增加线粒体清除。这与氧化应激通路富集结果一致，提示线粒体功能紊乱。

凋亡通路激活

差异表达基因富集于凋亡调控通路，与先前研究发现^HNRNPL敲低人原代肌管中caspase-3诱导的凋亡增加165倍的结果一致。

Notch信号通路的精细调控

研究发现Notch信号通路基因广泛下调，但具体机制复杂：^Fhl1编码的KyoT2和KyoT3是Notch共抑制因子，其下调可能减少Notch抑制；但另一方面，Notch抑制因子^Hey1也下调。这种精细调控反映Notch信号在肌生成中的复杂时空调节作用。

物种间保守性与差异

果蝇实验中^Limpet（^Fhl1/2直系同源物）上调与小鼠^Fhl1下调相反，可能反映功能分化：Limpet在果蝇中作为Wnt信号抑制因子而非Notch抑制因子发挥作用。

技术方法与灵敏度评估

本研究通过比较纳米孔RNAseq与PCR/qPCR结果，初步评估了纳米孔测序检测剪接变化的灵敏度：建议最小读深为10，才能可靠检测重复间差异大于10-20%的剪接模式。纳米孔直接RNA测序的3′偏好性限制了检测基因5′区域剪接事件的能力。

结论

hnRNP L通过调控Notch信号通路和肌肉功能相关基因的表达与剪接，在肌肉发育中发挥核心作用。其缺失导致剪接因子网络失衡（^Mbnl1/2）、自噬-凋亡平衡破坏（^Lamp2）、神经肌肉连接异常（^Stmn2、^Dtna）和肌肉分化受损（^Fhl1）。这些发现为理解肌肉发育机制提供了新视角，也为肌肉疾病治疗提供了潜在靶点。增强hnRNP L表达是否可作为肌肉疾病的治疗策略，值得进一步研究。