GCN5L1通过抑制PDH磷酸化在心脏缺血再灌注损伤中的保护作用及机制研究

本研究发现，线粒体蛋白GCN5L1在心脏缺血再灌注（I/R）损伤中通过双向调控丙酮酸脱氢酶（PDH）磷酸化状态发挥关键保护作用。GCN5L1缺失会上调PDK4表达并促进PDH抑制性磷酸化（Ser293），抑制葡萄糖氧化，加剧心肌损伤；而过表达则呈现相反效应。该研究揭示了GCN5L1-PDK4-PDH通路在心肌能量代谢调控中的新机制，为缺血性心脏病的治疗提供了潜在靶点。

　　

引言

缺血性心脏病是全球心血管疾病中最主要的致死原因，其中心肌梗死时冠状动脉完全闭塞导致心肌灌注丧失，引发心肌细胞凋亡和瘢痕形成。虽然再灌注治疗可恢复血流并减轻原发性缺血损伤，但也会导致继发性缺血再灌注（I/R）损伤，涉及活性氧（ROS）过量产生、线粒体功能障碍以及凋亡和炎症信号通路激活等多个机制。

除了这些经典机制外，心脏能量代谢的改变也扮演着重要角色。健康成年心脏主要通过脂肪酸氧化获取收缩所需能量，其余部分来自葡萄糖/丙酮酸氧化、酮体氧化和糖酵解。在缺血损伤期间，氧气供应丧失严重限制了心脏能量生产，此时非氧化的糖酵解过程最为重要。恢复正常氧化燃料代谢是收缩功能恢复的主要因素，可能调节恢复程度。这一过程中的关键环节是随着氧气供应恢复，糖酵解与葡萄糖/丙酮酸氧化的重新偶联，该过程的延迟会抑制完全恢复。此外，就每摩尔O₂消耗产生的ATP而言，葡萄糖是比脂肪酸和酮体更高效的燃料，这在低氧条件下尤为重要。

GCN5L1是一种定位于线粒体和细胞质的蛋白，先前研究已证明其在心脏细胞中调节燃料代谢。在体外模型中，GCN5L1基因下调会导致心脏细胞葡萄糖氧化减少，并在常氧条件下增加对糖酵解的依赖。本研究旨在探讨GCN5L1在I/R损伤中的作用，特别是其对丙酮酸脱氢酶（PDH）磷酸化的调控机制。

材料与方法

研究使用心肌细胞特异性条件性基因敲除小鼠（GCN5L1 cKO），通过在C57BL/6J背景上将αMHC-Cre小鼠与BLOC1S1（GCN5L1）基因第3外显子两侧引入LoxP位点的小鼠杂交获得。通过单次40 mg/kg腹腔注射他莫昔芬诱导心肌细胞特异性敲除，并在注射后4周通过qPCR和Western blotting验证。

心脏缺血再灌注损伤手术模型采用短暂冠状动脉结扎（CAL）手术，雄性小鼠麻醉后开胸，左前降支冠状动脉用8-0缝合线结扎45分钟，再灌注24小时。假手术组除冠状动脉闭塞外遵循相同程序。

心脏功能通过VisualSonics Vevo 3100系统进行经胸超声心动图评估，使用MS400（30 MHz中心频率）探头测量左心室射血分数（EF）、缩短分数（FS）和收缩/舒张期容积。

心肌损伤标志物血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌钙蛋白使用商业试剂盒测量。AC16细胞培养在标准条件下（20% O₂/5% CO₂，37°C），使用含25 mM葡萄糖的DMEM培养基。

通过慢病毒颗粒转导构建GCN5L1敲低（KD）和过表达（OE）的稳定细胞系，使用多重感染（MOI）为10，并通过嘌呤霉素筛选。缺氧/复氧实验使用Esumi缓冲液处理细胞3小时缺氧，随后1小时复氧。

蛋白质样品使用1% CHAPS裂解缓冲液提取，通过SDS-PAGE分离后转印至硝酸纤维素膜，使用Odyssey成像系统检测。抗体包括GAPDH、αTubulin、PDH、p-PDH（Ser293）、PDK4和GCN5L1等。

统计分析使用GraphPad Prism进行，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）后Tukey多重比较检验，两组比较采用双尾Student t检验，p < 0.05认为有统计学显著性。

结果

GCN5L1丰度与丙酮酸脱氢酶磷酸化呈负相关

在人心肌AC16细胞中，通过稳定过表达（OE）或敲低（KD）GCN5L1调节其丰度。GCN5L1过表达导致抑制性PDH磷酸化降低约50%（p = 0.06），而GCN5L1敲低则导致相同程度的PDH磷酸化显著增加。GCN5L1敲低细胞中PDH磷酸化的增加可能是由PDH激酶PDK4丰度的增加所介导，PDK4在Ser293位点磷酸化PDH。未观察到PDH磷酸酶PDP1的补偿性增加，而PDP1调节亚基PDPR的增加可能通过抑制PDP1活性进一步加剧PDH磷酸化。这些结果表明，GCN5L1蛋白丰度与心脏细胞中PDH磷酸化状态和活性呈负相关。

GCN5L1敲低加剧缺氧/复氧应激后PDH抑制蛋白表达

在缺血/缺氧状态下，PDH发生磷酸化，导致葡萄糖/丙酮酸氧化活性显著降低。研究发现，在缺氧/复氧（H/R）处理后，对照组和GCN5L1敲低AC16细胞中PDH磷酸化水平均显著增加，但两组间无差异，表明该处理下已达到最大PDH磷酸化水平，且不依赖于GCN5L1。然而，在GCN5L1敲低H/R细胞中，检测到PDK4和PDPR丰度相对于对照组显著增加。尽管PDP1蛋白表达有非显著性的约30%增加，可能部分抵消了这种增加（通常会导致PDH磷酸化增加）。这些数据表明，GCN5L1表达缺失在常氧和缺氧条件下都会驱动抑制PDH的蛋白表达。

GCN5L1敲除心脏在缺血再灌注损伤后显示PDH磷酸化升高

为探究GCN5L1缺失在体内心肌细胞对缺氧反应的影响，研究检测了诱导性心肌细胞特异性GCN5L1敲除（GCN5L1 cKO）小鼠中的PDH磷酸化。野生型（WT）和GCN5L1 cKO小鼠接受左降支冠状动脉手术缩窄45分钟短暂缺血，随后24小时再灌注。缺血再灌注（I/R）损伤后，WT小鼠中GCN5L1表达显著增加，而在GCN5L1 cKO小鼠中缺失。检测PDH磷酸化发现，GCN5L1 cKO小鼠在常氧下有不显著的p-PDH增加，而在I/R损伤后变为显著增加。这些数据表明，GCN5L1可能有助于缺血后PDH去磷酸化过程，促进糖酵解与葡萄糖/丙酮酸氧化的重新偶联。

GCN5L1缺失导致组织损伤标志物升高但无功能下降

研究进一步检验GCN5L1 cKO小鼠缺血后观察到的PDH磷酸化增加是否具有功能或病理生理后果。首先，再灌注24小时后通过超声心动图评估收缩功能。尽管I/R损伤后射血分数、缩短分数和左心室收缩容积均发生显著变化，但两种基因型间无显著差异。其次，评估GCN5L1缺失是否影响I/R损伤后的心脏组织损伤标志物。发现GCN5L1 cKO小鼠缺血损伤后血清心肌肌钙蛋白和乳酸脱氢酶水平相对于相同条件下的WT动物显著增加。这些数据表明，心肌中GCN5L1缺失会加剧缺血后的心脏组织损伤，但早期收缩功能无差异。

讨论

燃料代谢改变是心脏对缺血反应的内在组成部分。从氧化到糖酵解葡萄糖利用的转变（因可用氧气丧失而必需）导致ATP生成减少和心肌离子平衡的有害变化。虽然再灌注后脂肪酸氧化相对快速恢复，但葡萄糖/丙酮酸氧化的恢复常常延迟，这与功能恢复速度较慢有关。更好地理解缺血后氧化葡萄糖使用恢复的调控机制，可能有助于确定新的治疗靶点以促进心肌梗死后的恢复。

本研究显示，GCN5L1（已知的心脏燃料代谢调节因子）在PDH复合物活性中起关键调控作用。先前研究表明，在非缺血、营养过剩条件下，GCN5L1可乙酰化并抑制PDH活性。与此相反，本研究显示在正常营养和/或缺血条件下，GCN5L1表达是抑制PDK4对PDH抑制性磷酸化所必需的。心脏细胞中GCN5L1基因缺失会导致PDK4基因表达增加（数据未显示）和随后PDK4蛋白丰度增加，从而引起PDH复合物过度磷酸化，抑制其酶活性。GCN5L1表达缺失在体外缺血条件下促进PDK4表达额外增加，并在体内心脏I/R损伤后导致PDH磷酸化增加。GCN5L1 cKO小鼠I/R损伤后PDH磷酸化增加随后与心脏组织损伤增加相关，表明GCN5L1是保护心脏免受缺血损伤所必需的。

虽然心肌细胞中GCN5L1缺失导致I/R损伤后组织损伤增加，但在相同条件下未观察到心脏功能活动或结构重塑的差异。本研究的一个局限性是，在I/R损伤手术后24小时测量心脏功能和回收器官，未能通过补偿性结构重塑检查长期功能恢复。这方面的未来研究，让I/R损伤后恢复进行2-4周，将能够确定GCN5L1 cKO小鼠中观察到的初始组织损伤增加是否导致长期功能相对于WT小鼠下降。

本研究证明PDK4受GCN5L1表达调控，且GCN5L1与PDK4丰度间存在负相关关系。然而，这种调控的潜在机制仍有待确定。肝脏中GCN5L1缺失与FoxO1表达变化相关，FoxO1在心脏中已被证明调节PDK4表达。需要进一步研究以确定GCN5L1丰度与PDK4表达之间的直接关系。类似地，需要进一步工作以理解GCN5L1如何帮助调控PDPR的表达，即PDH磷酸酶蛋白PDP1的调节亚基。对PDPR的研究很少，早期工作表明它通过抑制其Mg²⁺依赖性催化活性负调控PDP1。本研究结果显示，PDPR表达增加可能与PDK4表达增加协同作用以增加PDH磷酸化。然而，这两种蛋白是否存在特异性共调控仍有待确定。本研究的最后一个局限性是未确定其他PDH激酶（如PDK1和PDK2）是否参与响应GCN5L1丰度变化的PDH磷酸化调控。需要进一步研究以确定GCN5L1表达水平是否双向调控这些额外激酶。

总之，本研究显示心脏中GCN5L1蛋白丰度与PDK4表达负相关，且GCN5L1基因缺失会导致抑制性PDH磷酸化增加和缺血时心脏组织损伤。这些发现表明GCN5L1可能是缺血后心脏葡萄糖/丙酮酸氧化恢复及随后功能恢复的重要组成部分。