纳米药物负载多孔聚乳酸/聚环氧乙烷核壳微粒的同轴电喷雾制备及其在肺部靶向给药中的应用研究

本综述系统探讨了利用同轴电喷雾技术制备负载生物活性端基树状大分子（TD）纳米药物的多孔聚乳酸（PLA）/聚环氧乙烷（PEO）核壳微粒，用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）的肺部靶向治疗。研究通过调控溶液粘度、表面张力及电喷雾参数，成功获得粒径1-5μm、具有均匀孔隙的球形微粒，显著提升药物在肺部的沉积效率与缓释特性。体外细胞毒性、溶血实验及药物释放曲线证实了该载药系统的生物相容性与治疗潜力，为非侵入性COPD治疗提供了创新策略。

　　

1 引言

生物相容性纳米至微米级颗粒因其增强药物稳定性、实现靶向与持续给药以及降低毒性的优势，在治疗应用领域展现出显著潜力。这类多功能颗粒系统能够递送从小分子到蛋白质和遗传物质等多种化合物，为慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病的治疗提供了灵活性。本研究团队开发了一系列新型生物活性免疫调节端基树状大分子（TD）纳米药物载体，可用于抑制Toll样受体（TLR2和TLR4），从而抑制COPD中的过度炎症反应。此外，TD纳米药物载体还能封装抗生素和生物治疗剂（如酶和生长因子），从而在感染控制和肺修复方面发挥协同作用。

针对COPD的治疗，吸入给药能够实现疾病部位的局部直接给药。然而，克服黏膜纤毛清除并实现更深部位的肺部递送仍然具有挑战性。有效的肺部给药和COPD的 prolonged drug release 需要具有理想质量中值空气动力学直径（MMAD）为1-5μm的微米级颗粒，以便封装治疗性纳米药物，实现有效沉积和持续释放。

静电喷雾已成为一种有前景的微球合成方法，具有操作简便、材料选择与用量灵活、可灵活控制颗粒尺寸和结构等优点。该技术能够制备先进的颗粒形态，包括核壳结构和多孔结构，使其特别适用于药物递送和生物材料应用。在电喷雾过程中，含有聚合物/药物和表面活性剂或添加剂的适当溶剂通过毛细管针头泵送，并施加高电压。施加在液体上的强电场导致针头末端形成泰勒锥，当表面张力与静电 force 之间的平衡被打破时，产生高度带电的单分散液滴。

设计具有不同形态和尺寸的微球至关重要，因为研究表明颗粒形状和尺寸在决定药物释放曲线方面起着重要作用。例如，多孔颗粒增加了表面积，提高了药物释放效率和渗透性，而颗粒尺寸和形状将影响药物在肺部的溶解速率和吞噬清除。此外，通过调整聚合物特性（如分子量、浓度、疏水性和渗透性）以及颗粒结构特征（包括表面孔径、孔隙分布和壳厚度）可以实现 controlled drug release。电喷雾颗粒的形成涉及几个相互关联的过程，包括溶剂蒸发、溶质扩散、库仑裂变以及颗粒的碰撞和凝聚，因为带电液滴在空气中飞行时被雾化、收缩和固化。这些过程之间的竞争和相互作用最终影响最终的颗粒尺寸和形态。

电喷雾颗粒的形态和尺寸可以通过材料特性（例如粘度、电导率、表面张力）、工艺参数（例如电压、流速、针尖到接收器的距离）和环境条件（例如温度、湿度）来控制。虽然颗粒尺寸可以通过流速和聚合物浓度来调节，但形状控制更为复杂，依赖于溶剂蒸发和库仑裂变等过程的相互作用。表面张力和粘度是影响电喷雾模式和形成颗粒的关键因素。粘度增加通常会稳定射流并延长射流持续时间，形成更大的颗粒，而低粘度则促进更小颗粒的形成。电喷雾中较低的表面张力通过促进更易的液滴破碎，有助于形成更小的颗粒尺寸和更均匀的尺寸分布。然而，过低的表面张力可能 destabilize the spray，导致不规则的颗粒形态。很少有研究探讨粘度、表面张力及其相互作用对电喷雾颗粒尺寸和形态的影响。因此，粘度、表面张力和颗粒形态之间的相关性仍不明确，需要验证它们对核壳电喷雾颗粒的影响。

在本研究中，我们探讨了溶液粘度和表面张力对颗粒尺寸和形态的影响，以优化利用电喷雾制备直径1-5μm的多孔核壳微球。这些颗粒 designed for 非侵入性肺部递送TD纳米药物载体， specifically targeting COPD治疗 through core-drug encapsulation。进行了细胞活力、体外细胞毒性和药物释放研究等应用测试，以评估其生物医学潜力。我们假设表面张力、粘度及其相互作用显著影响颗粒尺寸和形态。 accordingly，研究了各种参数组合，并总结了实现具有受控直径和表面孔隙的球形颗粒的最佳配方。还研究了药物释放曲线以显示疾病治疗潜力。

2 材料与方法

2.1 电喷雾溶液制备

聚乳酸（壳层溶液溶质，PLA，密度=1.24 g/cm³）颗粒购自Avantor Performance Materials（美国宾夕法尼亚州拉德诺）。聚环氧乙烷（核心层溶液溶质，PEO，分子量=100,000）粉末和十二烷基硫酸钠（SDS）粉末购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。氯仿购自Avantor Performance Materials（美国宾夕法尼亚州拉德诺）。去离子水（DI水）由Millipore Milli-Q系统获得。

聚乳酸（PLA）基微球因其可通过酶或非酶过程自然分解，产生安全且生物相容的人体副产物，随后被正常代谢系统清除，而在药物递送应用中受到广泛关注。聚环氧乙烷（PEO）由于其生物相容性和易溶于水的特性，被广泛用于药物递送和生物制造，使其成为一种合适的核心材料。氯仿因其低表面张力和高挥发性而被广泛用于电喷雾，这促进了液滴的快速蒸发并有助于形成具有光滑表面的球形颗粒。此外，其对许多聚合物的良好溶解性确保了均匀的溶液，这对于 uniform particle morphology 至关重要。表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）粉末被添加到PLA和PEO溶液中以降低表面张力。SDS表面活性剂降低了表面张力，而没有显著影响粘度。向聚合物溶液中添加表面活性剂旨在降低表面张力，从而增强电喷雾过程中的液滴雾化并导致形成更小的颗粒。SDS的存在还可以稳定电喷雾，导致更 uniform particle production。此外，先前的研究表明，SDS显著影响颗粒孔隙的形成。因此，值得研究其对微球孔隙率的影响。

通过将PLA颗粒溶解在氯仿中12小时（室温）来制备壳层溶液。将5%的乙醇（含或不含SDS）加入氯仿中作为共溶剂并产生多孔表面。将PEO粉末（含或不含SDS）溶解在氯仿中，直至在室温下完全溶解，以制备核心溶液。

2.2 核壳微球的电喷雾过程

电喷雾过程使用TL-Pro机器人静电纺丝平台（中国深圳通力科技）进行，该平台配备高达50 kV的高压电源。使用同轴不锈钢喷丝头，两个微型泵通过喷丝头输送核心和壳层溶液，如图1所示。在此设置中，两个注射泵独立地将核心溶液（PEO，含/不含药物）和壳层溶液（PLA）通过同轴喷丝头的内部和外部部分注入。在喷丝头和接地的铝箔收集器之间施加高电压（13-20 kV），在针尖形成双层泰勒锥，克服表面张力以喷射微球。针尖到收集器的距离（TTD）根据我们的初步研究设置为26 cm。除非另有说明，核心和壳层溶液分别使用22号和16号针头，核心-壳层流速设置为1:1 mL/h。

2.3 微球和溶液特性的表征

收集在铝箔上的微球经过溅射镀膜后，使用扫描电子显微镜（SEM，德国蔡司）进行成像。图2展示了颗粒圆形度、降解面积、直径和表面孔径的测量方法。在图2A中，红色圆圈代表圆形度路径，而黄色区域表示降解区域。降解面积百分比计算为降解面积（黄色）与总颗粒面积（红色）的比率。图2B和C分别说明了测定颗粒直径和表面孔径的方法。每组包括三个重复样品，从每个样品中随机选择20个颗粒，并使用ImageJ（美国国立卫生研究院）进行测量。聚合物溶液的粘度通过数字旋转粘度计（IKA，美国北卡罗来纳州威尔明顿）测量。聚合物溶液的表面张力通过毛细管上升法测量，并使用以下公式计算：γ = (2h·ρ·g·r)/2，其中h是液柱高度，ρ是密度，g是重力加速度，r是毛细管半径。

2.4 体外细胞毒性和药物释放研究

2.4.1 细胞培养

小鼠巨噬细胞系Raw 264.7和人单核细胞系THP-1购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。Raw 264.7细胞和THP-1细胞分别在补充了10% FBS、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的DMEM和RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。

2.4.2 细胞活力研究

将Raw 264.7细胞和THP-1细胞以每孔4×10³个细胞和8×10³个细胞的密度接种在96孔板中。Raw 264.7细胞和THP-1细胞分别经过 overnight 和30分钟孵育后，用不同浓度的微球处理。用于以下体外和药物释放研究的微球来自高表面张力-3%-16–18 kV组。孵育72小时后，根据制造商说明，向每孔加入Cell Titer 96 Aqueous Cell Proliferation Reagent，包括3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H四唑鎓（MTS）和电子耦合试剂吩嗪硫酸甲酯（PMS），并在37°C下进一步孵育2小时。通过使用酶标仪（BioTek Synergy H1）在490 nm处测量吸光度来确定细胞活力。未处理的细胞被视为对照。结果通过以下公式表示为三次重复孔的平均细胞活力：细胞活力% = [(OD_处理 ? OD_空白)/(OD_对照 ? OD_空白)] × 100%。

2.4.3 溶血试验

从健康人类志愿者采集新鲜血液，收集到20 mM EDTA PBS溶液中。通过以1000 rpm离心10分钟分离红细胞（RBCs）。经过三次PBS洗涤后，将RBCs重悬于PBS中。将微球以2、20和200 μg/mL的浓度添加到100 μL RBC溶液中，并在37°C下孵育0.5小时、4小时和24小时。将PBS和2% Triton X-100与RBCs孵育，分别作为阴性和阳性对照。通过NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific）在540 nm处测量上清液中的血红蛋白吸光度。通过以下公式计算溶血率：溶血% = [(OD_样品 ? OD_PBS)/(OD_triton ? OD_PBS)] × 100%。

2.4.4 体外药物释放

通过透析法测量阿霉素（DOX）制剂的药物释放曲线。将300 μL的自由DOX、DOX-TD、纳米颗粒嵌入的核壳颗粒（NECS）-DOX和DOX-MP制剂加载到具有3.5 kDa MWCO透析膜（Thermo Scientific，美国伊利诺伊州罗克福德）的透析盒中。将透析盒对40 mL PBS进行透析，并在37°C水浴中轻轻摇晃。每4小时更换一次PBS溶液。在不同时间点从透析盒内取出5 μL DOX溶液，并在10 μL DMSO中进一步稀释，然后通过酶标仪（BioTek Synergy H1）测量荧光强度（E_x/E_m 470/560 nm）。结果报告为三次重复样品的DOX释放平均百分比。

2.4.5 抗菌药敏试验

根据研究，使用肉汤微量稀释法进行庆大霉素（GM）制剂的抗菌药敏试验。将GM制剂在溶菌肉汤（LB）中制备成GM浓度为500 μg/mL的储备液。在96孔板中，于37°C下，使用含有不同GM制剂的20 μg/mL GM浓度的LB肉汤中的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）进行总体积为100 μL的实验。使用酶标仪（BioTek Synergy H1）在600 nm处监测细菌生长。

2.4.6 比浊法溶菌酶测定

制备不同Lyso制剂中溶菌酶（Lyso）的1000 U/mL储备液，并在4°C下储存过夜。在pH为6.24的缓冲液中制备0.2 mg/mL的藤黄微球菌（Micrococcus lysodeikticus）冻干细胞（M3770，Sigma Aldrich）悬浮液。将底物和Lyso溶液在比色皿中混合，Lyso的最终浓度为400 U/mL。在室温下，每分钟在450 nm波长下读取吸收值，持续5分钟，通过NanoDrop进行。

2.5 统计分析

2.5.1 制造参数研究

使用Minitab统计软件分析数据。对于两组比较应用t检验，对于同时检查两个自变量以评估聚合物浓度、溶液表面张力和施加电压的主效应及其对结果测量的 pairwise interactions，应用双向ANOVA。使用Tukey's Honest Significant Difference (HSD)检验进行事后 pairwise comparisons。结果表示为平均值±标准差（SD），每组n≥30。确切的样本量在图的说明中提供。统计学显著性定义为p < 0.05，图中用表示p < 0.05，*表示p < 0.001。

2.5.2 体外研究

数据表示为平均值±SD或平均值±平均值的标准误差（SEM）。使用GraphPad Prism进行统计分析，对两组比较应用Student's t检验，对多组应用单因素ANOVA。显著性阈值设定为p < 0.05 (), p < 0.01 (), p < 0.001 (), 和 p < 0.0001 ()。重复次数和数据呈现格式在图的图例中指明。图8A的统计分析包含在图S1中。

3 结果与讨论

核壳电喷雾机制确保将纳米药物封装在颗粒核心。针尖的带电液体形成双层泰勒锥。当聚合物溶液通过长毛细管并形成 rapidly expanding fluid jets 时，分散相由于其沿射流方向飞行过程中的 elongation effect 而倾向于在液体中心积聚。这种现象有助于将纳米药物 incorporated within the particle core 而不是表面积聚，促进核壳结构的形成。

电喷雾采用高压电场在聚合物溶液穿透毛细管尖端液面时引发正负电解质离子分离。该过程中的一个关键因素是液体的表面张力，它可能导致电晕放电发生在电喷雾之前。降低电喷雾过程中聚合物溶液的表面张力 may enhance atomization, reduce particle size, and influence porosity，因为当表面张力和 electrical force 之间的平衡被破坏时会发生雾化。将纳米药物纳入核心溶液会改变表面张力，因此研究表面张力对颗粒形成的影响非常重要。在这里，我们使用SDS来调节溶液的表面张力，创建了两个水平的表面张力。低表面张力组包含0.05% SDS，表面张力约为22.4 mN/m，而高表面张力组的值为28 mN/m。此外，溶液粘度也会影响颗粒形成。通常，较高的聚合物浓度会增加粘度，这会影响液滴形成和稳定性，最终导致颗粒尺寸和形态的变化。在本研究中，通过改变聚合物浓度在1%、2%和3% w/v来控制粘度。对于PLA溶液，粘度分别为7.12、10.65和13.5 mPa·s，而对于PEO溶液，粘度分别为6、11.3和14.5 mPa·s。因此，检查了两个水平的表面张力和三个水平的粘度（由聚合物浓度定义）。核心和壳浓度在每个实验组中保持在同一水平，因为我们假设基于先前的研究，相似的核心-壳粘度将导致稳定的电喷雾和封装。电喷雾射流可能在核心-壳粘度显著不同的情况下形成 stream before breaking up into droplets，这可能影响颗粒形成的稳定性和均匀性。

3.1 颗粒形态

施加的电压范围在13至20 kV之间：在13-15 kV时，观察到长泰勒锥；在16-18 kV时，形成较短的锥体；在19-20 kV时，不存在锥体，但观察到 skewed stream。图3说明了颗粒形态如何随着表面张力、浓度水平和施加电压的变化而变化。可以观察到，当溶液浓度/粘度增加时，颗粒更加球形。先前的研究表明，当聚合物浓度低于临界水平时，由于聚合物缠结不足，颗粒倾向于坍塌并失去球形形状。图3A和B显示，表面活性剂对球形颗粒的贡献并不积极，并且很明显，较低表面张力与3%浓度促进了静电纺丝纤维与电喷雾颗粒的形成。1%和2%浓度与较低表面张力导致更小但变形的颗粒。这可以通过射流泰勒锥在较高粘度下保持其形状的能力增加以及当 electrical force 倾向于超过泰勒锥中降低的表面张力以进行射流时易于静电纺丝来解释。此外，表面活性剂的添加加速了库仑裂变，导致其在过程中更早发生。研究表明，如果聚合物缠结发生在库仑裂变之后，颗粒形态会从球形变形。我们来自图3A和B的结果证实，实现球形颗粒需要聚合物浓度高于某个阈值（≥3%）以确保足够的聚合物缠结，并且浓度水平和表面活性剂水平对圆形度都具有显著性，p值小于0.0001。此外，当使用低粘度溶液时，添加表面活性剂不会产生更小的球形颗粒，因为在这些条件下，库仑裂变将总是先于聚合物缠结发生，导致坍塌的、非球形颗粒。

为了实现球形颗粒，施加的电压需要控制在稳定范围内。过低或过高的电压会导致颗粒变形。低电压由于 insufficient electrical force 用于 proper jet formation 而导致滴落或坍塌的颗粒。相反，过高的电压增加了电喷雾颗粒的速度，并由于溶剂蒸发不足以及可能收集器上的高接触速度而导致扁平颗粒。在图3C中，尽管圆形度数据没有揭示施加电压对颗粒形态的任何显著影响，但超过19 kV的电压显著降低了表面孔隙率。总体而言，15-18 kV范围内的电压与3%聚合物浓度相结合，产生了具有明确表面孔隙的最佳球形颗粒，如图3A中的红框所示。

尽管球形颗粒具有更可预测的空气动力学行为、更好的分散性和更高的崩解速率，这可以提高肺部某些区域的沉积效率，但 elongated particles 有利于粘附到细胞膜上，但仅在其圆形末端被内化，这种行为可以改善肺部沉积并有助于逃避巨噬细胞清除。在本研究中，优选球形颗粒以确保与破裂或不规则颗粒相比完全的药物封装；然而，其他形态，如 elongated, donut-shaped particles，将在未来的研究中探索。

3.2 颗粒尺寸

根据统计分析，表面张力、粘度、电压以及它们之间的相互作用对颗粒尺寸有显著影响。图4A说明，增加的粘度有更高的机会产生具有增加标准偏差的更大颗粒。为了减小颗粒尺寸，可以降低聚合物浓度，但它必须保持在临界缠结浓度以上。低于此阈值可能导致不稳定的射流和坍塌的颗粒。图4B证明了较低表面张力确实有助于减小颗粒尺寸的结果，这与Shakri的研究一致，因为较低表面张力 facilitates the Coulomb fission。添加SDS的较低表面张力（ST）组通常产生比非SDS组尺寸小约2μm的颗粒。然而，形态并不理想，因为表面活性剂的添加也促进了静电纺丝纤维的形成。解决这个问题的一个潜在方案是进一步降低表面活性剂浓度或用TD纳米药物替代表面活性剂，这可能会略微降低表面张力而不会诱导纤维产生。图4C显示，与表面张力和聚合物浓度相比，施加电压对颗粒尺寸的影响在我们的案例中不太明显，因为13-20 kV的范围落在稳定喷雾区域内。根据SEM图像，16至18 kV之间的电压最有可能产生球形颗粒。相反，低于或高于此范围的电压导致轻微的颗粒坍塌，导致颗粒直径略有增加。

图4D以箱线图形式展示了整体颗粒尺寸分布，包含了所有变量。通常，聚合物浓度和颗粒尺寸呈正相关，较高浓度导致更大颗粒。较低表面张力 consistently reduces particle sizes with lower standard deviations。相反，高表面张力（ST）组表现出更广泛的颗粒尺寸范围，因为高ST抵抗液体射流破碎成均匀液滴。这导致 less controlled atomization，在库仑裂变期间产生更大颗粒，并且与低ST组相比，后续裂变事件更少。结果，颗粒尺寸分布变得更加分散，导致更大的标准偏差。高ST-2%-19–20 kV组中的颗粒尺寸异常大，因为高电压（19-20 kV）与2%聚合物浓度相结合，导致大多数颗粒坍塌或拉长。在当前最佳形态组（高ST-3%-16–18 kV）中，75%的颗粒小于7μm。这表明通过优化表面活性剂浓度、降低流速或选择性过滤所需尺寸范围内的颗粒，有可能进一步将颗粒直径减小到5μm以下。为了避免当通过吸入给药时颗粒直径大于10μm的 mucociliary clearance 和纳米级颗粒的呼出颗粒，需要具有1-5μm理想质量中值空气动力学直径（MMAD）的颗粒将药物 deep into the alveolar epithelium。因此，未来有必要优化实验参数，如表面活性剂浓度和流速，以进一步将颗粒直径减小到5μm以下。值得注意的是，研究表明，当它们的孔隙率将MMAD降低到5μm以下时，超过7μm的颗粒仍然可以到达深部肺组织。此外，较大的微球可以逃避肺泡巨噬细胞的吞噬作用，因此延长药物停留时间并增强治疗效果。

3.3 表面孔隙

表面活性剂的添加通过改变固化过程中溶剂和聚合物之间的相互作用，在电喷雾颗粒的表面孔隙形成中起着至关重要的作用。表面活性剂-聚合物相互作用可以改变聚合物的分子结构和动力学，从而影响聚合物分散体的流变学和界面性质，这反过来又影响表面孔隙的形成。在图5A中，在低浓度（1%和2%）和较低ST组中，观察到更小、更精细、更均匀的表面孔隙。表面活性剂在静电纺丝或电喷雾过程中促进孔隙率的作用也已被其他小组证明，他们利用各种表面活性剂生产多孔纤维或膜。然而，在较高聚合物浓度（3%）下，表面活性剂可能在固化过程中 destabilize polymer distribution，导致不同的孔径和纤维的形成。此外，在高电压条件下（>16 kV），非表面活性剂组中的颗粒由于加速溶剂蒸发和快速固化而失去孔隙率，而含表面活性剂组无论电压如何都保持表面孔隙率。总体而言，表面活性剂 enhance pore formation and stability，但由于固化过程中的相分离，在高聚合物浓度下可能引入孔径可变性。

3.4 降解分析

该降解测试旨在模拟体内环境，并研究核壳微球随时间降解的情况，为了解潜在的药物释放曲线提供见解。PLA的水解生物降解涉及水分子分解聚合物，导致PLA链中酯键的断裂。这个过程产生更小的乳酸分子，这些分子可以进一步代谢或从体内消除。许多研究检查了PLA的降解速率，该速率根据pH、温度和分子量等因素而有显著差异。例如，直径为18.6μm的编织PLA纤维在12个月内降解，而直径 around 10–15μm的PLA纤维在pH条件为2、3、7.4和10的情况下在25天内降解。在我们的实验中，将PLA微球浸入37°C的Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)中，在灭菌培养箱中特定持续时间。在每个时间点，从液体中取出样品，风干，并使用SEM观察降解情况。测量了降解面积，因为由于液体中潜在的颗粒损失，控制颗粒重量具有挑战性。

图5B说明了微球在3周内的降解情况。在第0天，样品在水中浸泡2小时，显示没有表面破裂，表明PLA壳的完整性，并排除了电喷雾过程中潜在的PEO泄漏，因为PEO可以很容易地溶解在水中。到第3天，表面开始出现空隙，到第3周，碎片已积聚在地上。表面降解面积显著增加，到第3周，近50%的PLA颗粒表现出表面破裂。这种相对快速的降解可归因于电喷雾中低的PLA浓度（3%）。此外，表面孔隙率促进了液体渗透性，允许PEO核心溶解，而薄壁厚度和小颗粒尺寸进一步提高了降解速率。

3.5 体外细胞毒性分析

在RAW 264.7小鼠巨噬细胞和THP-1人单核细胞培养物中评估了设计的空白微球（MP）和TD封装微球的体外细胞毒性。将浓度范围为0.2 ng/mL至200 μg/mL的空白微球和TD封装微球与RAW 264.7和THP-1细胞孵育72小时。与空白微球或TD封装微球孵育后，RAW 264.7和THP-1细胞的细胞活力均出现无统计学意义的下降（图6A,B）。可以得出结论，空白微球和TD封装微球在高达200 μg/mL的浓度下均无细胞毒性。此外，在 overnight incubation 后，在浓度高达200 μg/mL的空白微球和TD封装微球中未观察到溶血毒性（图6C）。

3.6 体外药物释放、抗菌和酶活性分析

图7A和B说明了核心中含和不含TD纳米药物的不同颗粒。在图7A中，核心仅包含PEO，观察到光滑的颗粒表面和均匀分布的孔隙。相反，图7B显示了掺入TD纳米药物的颗粒，其表现出起皱的颗粒表面和不均匀分布的表面孔径。图7C说明，浸泡在水中8小时后，表面孔径增加，导致壳开口，突出了其 sustained drug release 的潜力。

3.6.1 体外药物释放

通过在sink condition下，即在37°C下于PBS中频繁更换PBS，通过透析法评估了DOX制剂的体外药物释放曲线。透析2小时后（图8A），自由DOX表现出完全释放，并且从纳米载体嵌入的核壳微球（NECS (DOX)）中释放的DOX少于20%，这显著慢于DOX-TD和DOX-MP的DOX释放（约30%）。在剩余的20小时内，在DOX-TD和DOX-MP制剂中观察到线性DOX释放曲线。相比之下，NECS(TD)表现出缓慢且持续的DOX释放，24小时内释放50%的药物。NECS (DOX)制剂中没有突释的 sustained release profiles 可以通过NECS的疏水性PLGA多孔壳减少突释来解释。

3.6.2 体外抗菌活性

为了评估GM制剂的体外抗菌活性，在药物测试中应用了通常易感的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）。在铜绿假单胞菌培养物中未观察到NECS（仅TD）的抗菌活性。如图8B所示，所有GM制剂在GM浓度为20 μg/mL时， overnight incubation 后均显示出对铜绿假单胞菌生长的显著抑制，表明GM可以从GM-TD和NECS (GM)制剂中有效释放。

3.6.3 比浊法溶菌酶测定

为了评估Lyso制剂的酶活性，使用比浊法进行活性测试。制备Lyso-T