全外显子测序揭示四个遗传性眼病家系的致病突变谱并拓展ALMS1基因新变异

本刊推荐：本研究通过纯合子定位与全外显子测序（WES）技术，对四个克什米尔遗传性眼病家系进行基因诊断，发现ALMS1基因新型纯合移码缺失突变（c.5747_5750del）及CNGA3、FYCO1基因已知突变。通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证突变体mRNA稳定性，首次报道该ALMS1突变逃避无义介导的mRNA降解（NMD）机制，为基因型-表型关联提供新见解。

　　

引言

遗传性眼病是全球视力丧失的重要病因，据世界卫生组织估计约22亿人存在不同程度的视力障碍，其中相当比例患者自儿童期即失明。在巴基斯坦等发展中国家，由于基因诊断基础设施薄弱，许多患病家系尚未获得分子诊断。人类眼球的发育和功能维持需要多事件协同调控，任何环节异常均可导致先天性眼病（CEDs），约影响千分之一人群。先天性白内障（CC）是全球致盲主因，在巴基斯坦视觉障碍儿童中占比高达23%。遗传性视网膜营养不良（IRDs）则涉及光感受器进行性丧失，其中色盲症（ACHM）属于非进展型IRDs，发病率约1/30,000。Alstrom综合征（AS）作为纤毛病的一种，表现为锥杆细胞营养不良伴全身多系统异常，发病率仅约1/1,000,000。

目前已知78个基因与CC相关，281个基因与综合征/非综合征型IRDs相关（RetNet数据库）。临床表型重叠和遗传异质性为CEDs诊断带来巨大挑战。尽管二代测序（NGS）技术（包括靶向Panel测序、全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS））已革新遗传诊断格局，仍有25%–50%的CED患者未获分子诊断。

材料与方法

本研究经米尔普尔科技大学高级研究委员会和真纳大学生物伦理委员会批准，遵循赫尔辛基宣言原则获取知情同意。共招募4个家系15名患者和13名健康成员，收集临床资料并绘制家系图。根据表型特征对患者进行B超、眼底镜、光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）等检查。采集外周血样本进行DNA提取。

对两个先天性白内障家系（A和B家系）进行Infinium Human Core Exome芯片550K SNP位点基因分型，通过纯合子作图识别患病个体共享>1 Mb的纯合区域（ROH）。对每个家系先证者进行Roche NimbleGen SeqCap EZ全外显子测序（中位深度77×），使用Burrows-Wheeler比对器（BWA）比对至GRCh37/hg19参考基因组，GATK进行变异检测，wANNOVAR进行注释。筛选外显子和经典剪接位点变异，保留罕见（gnomAD MAF<0.01）的终止增益、移码/框内 indel、错义及剪接变异。错义变异致病性通过MutationTaster、SIFT、Polyphen-2、PROVEAN、FATHMM和CADD（评分≥15）等多工具预测，剪接变异通过SpliceAI（delta score>0.2）预测。最终通过Sanger测序进行家系共分离验证。

针对ALMS1基因c.5747_5750del突变，使用Tempus血液RNA管采集患者、携带者父母和健康对照外周血，提取RNA并逆转录为cDNA，以YWHAE为内参基因，通过SYBR Green qPCR检测ALMS1相对mRNA表达量（ΔΔC_T法）。

结果

临床分析

四个家系均符合常染色体隐性遗传模式（图1A）。A家系（V-1、V-2、VI-1、VI-2、VI-4）和B家系（IV-2、IV-4、IV-5）患者表现为出生6个月内发生的双侧白内障。A家系V-1个体B超显示晶状体混浊（图1B），B家系IV-5个体还伴有虹膜缺损。C家系（IV-1、IV-2、IV-4）表现为锥杆细胞营养不良伴畏光，D家系（V-1、V-2、V-4、V-5）为色盲症伴畏光。C家系患者还呈现肥胖、牙齿异常、轻度听力损失、身材矮小、发育迟缓及黑棘皮症等AS典型特征（图1C）。C家系IV-1（15岁）和IV-4（11岁）眼底检查显示玻璃膜疣、视盘苍白和动脉变细（图1D）。D家系V-5（12岁）眼底正常，V-2（22岁）显示黄斑变性（图1E），SD-OCT显示外层视网膜（椭圆体带、交错带、外界膜和外核层）广泛退化（图1F）。详细临床特征见表1。

遗传分析

A家系全基因组SNP分型发现染色体3q42.41-47.60 Mb区间存在5.19 Mb纯合区域（图2A），包含43个白内障相关基因。B家系未发现>1 Mb的纯合区域。WES在A家系先证者V-1中发现FYCO1基因纯合无义突变c.2206C>T（p.Gln736），B家系先证者IV-5中发现FYCO1纯合剪接位点突变c.3150+1G>T（p.?）。两者均为巴基斯坦家系中已报道的致白内障突变。SpliceAI预测c.3150+1G>T可能导致9 bp框内缺失（供体丢失得分=1.00，供体增益得分=0.73）。D家系先证者V-4中发现CNGA3基因纯合错义突变c.1315C>T（p.Arg439Trp），为已知色盲症致病突变。C家系先证者IV-1中发现ALMS1基因新型4 bp纯合缺失c.5747_5750del（p.Ala1916Glufs21）。所有变异均经家系共分离验证，符合ACMG/AMP致病性标准（表2）。

ALMS1突变体mRNA稳定性分析

针对ALMS1 c.5747_5750del突变（引入提前终止密码子PTC），qRT-PCR显示患者血液细胞中ALMS1 mRNA表达量与健康对照相当，携带者表达量升高2倍（图2B）。表明该突变未触发无义介导的mRNA降解（NMD），可能产生截短蛋白。

讨论

巴基斯坦近亲结婚率超60%，罕见出生缺陷高发。纯合子作图虽可用于隐性突变定位，但B家系未发现>1 Mb纯合区域，A家系发现的纯合区域包含40余个候选基因，提示在高度近亲人群中，WES等测序技术可能比纯合子作图更高效。本研究WES诊断率为100%，凸显其在高 consanguinity 人群中的优势。

FYCO1基因编码自噬衔接蛋白，功能缺失导致自噬体运输障碍，引发晶状体混浊。A家系p.Gln736和B家系c.3150+1G>T突变均影响 coiled-coil 结构域。迄今FYCO1已知28个致白内障突变，57%为截断突变，其中exon 8是突变热点（15%巴基斯坦白内障家系与此相关）。p.Gln736曾在埃及、伊朗和巴基斯坦家系中反复出现（图3A）。

CNGA1基因编码视锥细胞环核苷酸门控通道α亚基，p.Arg439Trp突变位于C-linker区域，影响cGMP敏感性，导致色盲症。该基因已发现290余个突变，exon 8是主要热点（含>200个突变），与色盲症、锥杆细胞营养不良和黄斑营养不良均相关，25%色盲症患者由此基因突变引起（图3B）。

ALMS1基因突变导致Alstrom综合征，其蛋白参与纤毛功能、细胞内运输和蛋白转运。目前已知>460个ALMS1致病突变，85%–97%集中于exon 8、10和16。exon 8含约250个突变，90%为无义/截断突变。通常PTC会触发NMD，但本研究发现c.5747_5750del突变体mRNA稳定性正常，可能产生C端缺失的截短蛋白（p.Ala1916Glufs*21），影响蛋白中心体定位。既往研究显示87%携带无义突变的患者缺乏蛋白表达，而可检测蛋白的患者多表现为迟发、缓慢进展的症状。本研究中患者mRNA稳定但症状早发且严重，提示可能仍存在蛋白稳定性问题，需进一步功能验证。

结论

遗传诊断有助于明确并发症、家系咨询、疾病管理和未来治疗策略。WES是遗传性眼病高效诊断工具。本研究首次报道ALMS1基因c.5747_5750del突变逃避NMD的机制，拓展了突变谱，并强调基因型-表型关联研究对理解疾病机制和蛋白功能的重要性。