A组链球菌M蛋白D结构域疏水残基调控α螺旋性、寡聚化及表面锚定的机制研究

本综述深入探讨了A组链球菌（GAS）中与纤溶酶原结合M蛋白（PAM）D结构域的结构与功能关联。研究通过构建PAMAP53的9A、9G和9L突变体，结合圆二色谱、分析超速离心及表面等离子共振等技术，揭示了D结构域在维持蛋白二级/四级结构、细菌表面锚定及调控纤溶酶原（hPg）激活中的核心作用。该研究为针对GAS感染的靶向治疗策略提供了重要理论依据。

　　

1 引言

A组链球菌（Group A Streptococcus, GAS）是一种革兰氏阳性人类病原体，可引起从轻微软组织感染到致命性中毒性休克综合征等多种疾病。其表面表达的M蛋白（M-Prt）是关键的毒力因子，其中能直接高亲和力结合人纤溶酶原（human plasminogen, hPg）的亚型称为纤溶酶原结合M蛋白（PAM）。PAM通过捕获hPg并借助细菌分泌的链激酶2b（SK2b）将其激活为纤溶酶（hPm），使GAS获得蛋白酶活性，从而降解宿主纤维蛋白和细胞外基质成分，促进细菌侵袭和扩散。

M蛋白包含多个保守结构域：N端高变区（HVR）、A、B、C和D结构域，其后是富含脯氨酸/甘氨酸的区段（P/G区）和用于细胞壁锚定的sortase A识别基序。近期冷冻电镜结构解析发现，PAM_AP53的C和D结构域并未形成典型的卷曲螺旋，而是分别采取三螺旋束（THB）和螺旋-环-螺旋（HLH） motif。尽管D结构域在M蛋白中高度保守，其具体结构和功能作用尚不明确。

2 结果

2.1 PAM_AP53变体构建

研究基于PAM_AP53的冷冻电镜结构（PDB: 8TVL）和D结构域七肽重复模式，设计了三种全长变体：将9个关键残基替换为丙氨酸（9A）、甘氨酸（9G）或亮氨酸（9L）。9G变体主要替换了参与HLH motif稳定的疏水残基和两个谷氨酰胺，以破坏螺旋结构；9A和9L变体则旨在增强螺旋稳定性和疏水簇聚集。

2.2 变体均一性

所有变体在大肠杆菌中成功表达并纯化，SDS-PAGE和Western blot验证了其高纯度和免疫反应性。

2.3 二级结构分析

圆二色谱显示，在25°C下，WT-PAM_AP53的螺旋含量为36%，9A和9L变体分别增至89%和100%，而9G变体降至16%。37°C时，9L变体仍保持97%螺旋性，表明亮氨酸替换显著增强了螺旋的热稳定性。

2.4 寡聚化状态

分析超速离心表明，WT-PAM_AP53在25°C下形成浓度和温度依赖的二聚体、四聚体及高级寡聚体混合物，37°C时主要解离为单体。9A变体以二聚体为主，9G变体始终为单体，而9L变体则稳定形成三聚体，且不受浓度和温度影响。

2.5 hPg结合亲和力

表面等离子共振分析显示，所有变体在25°C和37°C下均保持纳摩尔级的高亲和力（K_D值在6-50 nM范围内），表明螺旋稳定性和寡聚状态对hPg结合影响较小。

2.6 hPg激活功能

在溶液体系中，WT、9A和9L变体均能显著增强SK2b介导的hPg激活，其中9L的增强效果是WT的两倍。相反，9G变体的促进作用比WT低5倍。在37°C下，所有变体的激活速率均比25°C时提高约2倍。

2.7 细菌表面展示与功能

流式细胞术显示，表达9A和9L变体的同源GAS菌株能正常将PAM锚定于细胞表面并结合hPg，而9G变体的表面表达量仅为WT的20%，且几乎不结合hPg。相应地，表面展示的9G变体对hPg激活的促进作用与PAM缺失株相似。

2.8 转录与蛋白定位分析

定量PCR证实9G变体的转录水平略低，但Western blot显示其细胞壁锚定效率显著下降，大量蛋白释放到培养上清中，表明D结构域的螺旋性和疏水残基对sortase A介导的细胞壁共价锚定至关重要。

3 讨论

本研究首次系统阐明了PAM的D结构域通过其疏水残基维持HLH motif，进而调控蛋白整体二级/四级结构、细菌表面锚定及hPg激活功能的关键作用。9L变体通过亮氨酸替换形成完美七肽重复，驱动稳定三聚体形成，并显著增强溶液中的hPg激活；然而，其在细菌表面的寡聚可能限制了SK2b与PAM/hPg复合物的结合，导致激活效率低于WT。9G变体则因螺旋结构破坏和HLH motif丧失，无法有效锚定于细胞壁，且虽能结合hPg却无法正确引导其被SK2b激活。

D结构域作为最接近细菌表面的胞外域，其氨基酸组成和结构特性可能直接影响sortase A的转肽反应效率。该结构域在M蛋白中的保守性提示，其可能进化为一类确保M蛋白高效展示于GAS表面的通用策略。

4 材料与方法

通过基因合成和同源重组构建了PAM_AP53的9A、9G和9L变体及相应同源GAS菌株。蛋白表达纯化后，采用圆二色谱、分析超速离心、表面等离子共振、纤溶酶原激活 assay、流式细胞术、Western blot和qRT-PCR等技术进行了系统表征。

作者贡献与致谢

研究由Olawole Ayinuola和Yetunde A. Ayinuola主导实验和数据分析，Zhong Liang参与方法学构建，Francis J. Castellino负责课题设计、资金获取和论文撰写。工作获得美国NIH基金（HL-013423）和圣母大学内部资金支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。