针对产气荚膜梭菌肠毒素C端结构域的合成抗体结构与结合机制研究及其在靶向治疗中的应用

本综述系统解析了合成抗体片段（sFab）COP-2与产气荚膜梭菌肠毒素C端结构域（cCpE）的高分辨率复合物结构（X射线晶体学2.50 ?、冷冻电镜2.95 ?），揭示了其通过"自行车卡钳制动"机制结合cCpEβ5-6链的分子基础。研究阐明了cCpE突变体（如cCpE5-6）对结合的影响，并创新性提出利用cCpE破坏紧密连接屏障的特性，构建"特洛伊木马"策略，通过COP-2偶联药物实现组织选择性递送，为靶向claudin过表达癌症和血脑屏障调控提供了新思路。

　　

1 引言

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）F型菌株分泌的肠毒素（CpE）可通过结合肠道中的claudin蛋白受体引起食物中毒。CpE是由319个氨基酸组成的双结构域蛋白，其中N端结构域（nCpE，1-200位氨基酸）负责细胞毒性，C端结构域（cCpE，200-319位氨基酸）介导与claudin的结合。cCpE首先与上皮细胞间紧密连接处的claudin蛋白结合，随后nCpE形成β桶状孔道导致细胞毒性。由于cCpE能破坏claudin间的相互作用而非引起细胞死亡，其已成为研究紧密连接和肿瘤靶向的重要工具。然而，目前缺乏特异性研究CpE/cCpE的分子工具。本研究团队此前通过噬菌体展示技术筛选出两个结合cCpE的合成抗原结合片段（sFab）COP-2和COP-3，但低分辨率结构限制了对其结合机制的深入理解。

2 结果

2.1 cCpE/COP-2复合物结构解析

通过X射线晶体学（2.50 ?）和冷冻电镜（2.95 ?）分别独立解析了cCpE/COP-2复合物结构。晶体结构显示不对称单元中包含三组cCpE/COP-2复合物，空间群为I121。冷冻电镜样品中虽加入了claudin类似物CLN1_18（K_D=3.2 μM），但最终获得的2.95 ?分辨率地图中仅观察到cCpE/COP-2复合物。

2.2 结构相似性与差异性分析

晶体与冷冻电镜结构中的cCpE和COP-2可变域结构高度一致（RMSD=0.60 ?），但恒定域在晶体堆积作用下发生了约40°的肘部旋转。cCpE的β5-6连接环（Asn267-Asn269）在晶体中因分子间相互作用发生180°旋转，但这些变化均未影响结合界面。

2.3 COP-2识别cCpE的分子机制

COP-2通过重链（H链）主导结合（界面面积807 ?² vs. 轻链245 ?²）。重链互补决定区CDR-H1（54-59）、CDR-H2（78-83）和CDR-H3（126-135）与cCpE的269-274区域形成关键相互作用，其中CDR-H3嵌入cCpE的β1、β3、β5、β6和β8链形成的表面沟槽。轻链仅CDR-L3（Glu118和Trp119）参与结合，Trp119深入cCpE的Val299、Lys301（β8）与Asp260、Asn262（β5）之间的空隙。

2.4 突变体验证结合机制

通过生物膜干涉技术（BLI）验证了cCpE突变体对结合的影响。突变体cCpE⁵（²⁷⁰NLV²⁷²→AAA）和cCpE⁶（²³⁷KLN²³⁹→ALA）均完全丧失与COP-2的结合能力（K_D=50.1 nM→无结合）。COP-3同样依赖这些区域（K_D=150.2 nM），证实两者共享结合表位。

2.5 突变导致结合丧失的结构基础

cCpE^3-5突变（β5-6区域）通过改变局部二级结构（可能转为α螺旋）削弱COP-2的锚定；cCpE⁶突变（β3区域Lys237/Asn239→Ala）则直接破坏与CDR-H3/CDR-L3的氢键网络（如Lys237与Tyr134/Glu118的相互作用）。

2.6 高低温分辨率结构对比

与此前低分辨率结构（7TDM 6.9 ?；9BEI 4.2 ?）对比显示，尽管侧链建模存在差异，但COP-2 CDR的整体构象与高分辨率结构一致，验证了前期结论的可靠性。

2.7 其他结构观察

结构叠加表明，CpE全长蛋白中nCpE结构域会空间阻碍COP-2的L链和CDR-H3与cCpE结合，解释了为何COP-2不能结合全长CpE或抑制其细胞毒性。AlphaFold3预测未能准确复现实验结合模式，凸显了实验结构解析的必要性。

3 讨论

本研究揭示了COP-2通过"自行车卡钳制动"机制结合cCpEβ5-6链的独特模式，其依赖cCpE表面拓扑而非特定侧链相互作用。晶体与冷冻电镜结构的高度一致（ despite 方法学差异）证明了结果的可靠性。cCpE^5-6突变体的结合丧失验证了β3和β5-6区域的关键作用。基于COP-2/cCpE结合特性（K_D=50 nM）远弱于cCpE/claudin结合（K_D<300 nM），研究提出了创新的"特洛伊木马"策略：利用cCpE破坏靶组织紧密连接屏障，同时通过COP-2偶联药物实现选择性旁细胞转运。该策略可克服cCpE-药物偶联物因高亲和力滞留于claudin的问题，通过调控COP-2解离速率实现可控递送。

4 方法

4.1 蛋白纯化与结晶

cCpE与COP-2按1.1:1摩尔比混合，经Superdex 200 Increase色谱纯化，结晶条件为1.75 M硫酸铵、200 mM NaCl、100 mM sodium cacodylate pH 6.6。

4.2 晶体结构解析

数据收集于APS GM/CA 23ID-D光束线，采用分子置换法（Phaser）解析，最终模型R_work/R_free=0.178/0.225。

4.3 冷冻电镜结构解析

使用300 kV Titan Krios G4显微镜（SelectrisX能量过滤器、Falcon IV探测器）采集数据，cryoSPARC处理流程最终获得2.95 ?分辨率地图。

4.4 突变体构建与BLI检测

定点突变采用引物介导的突变策略，BLI检测使用Octet R8仪器，Ni-NTA生物传感器固定组氨酸标签cCpE（1000 nM），分析物为未标签COP-2/COP-3（250 nM）。