综述：PET降解酶的多样性：序列、结构与功能的系统性综述

本综述系统梳理了聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）水解酶（PETases）的序列多样性、结构特征与功能机制，整合48篇文献数据构建了首个包含99种天然PETase功能活性的数据库PANDA。文章揭示了PETase进化起源于多种α/β水解酶（ABH）家族成员，其结构保守性高于序列一致性，且高效降解能力分布于多个系统发育分支。作者进一步分析了中温（如FAST-PETase、Z1-PETase）与高温（如LCC-ICCG、LCC-A2）工程酶的产业化进展，指出结晶性PET降解、酶半衰期优化及反应温度平衡是未来突破方向，为酶法回收PET提供了全面指导。

　　

2 PET降解活性源于多样化的序列背景

PET水解酶（PETases）的序列多样性通过序列相似性网络（SSN）和系统发育分析得到证实。研究表明，PETases可聚类为3-5个组群，部分酶以单例形式存在。在约20%序列一致性阈值下，94个PETase序列可划分为三个主要簇群和五个单例。簇1（78.7%）以细菌和古菌来源酶为主，簇2（9.6%）主要为真菌来源，簇3（7.4%）虽为细菌来源但独立于簇1，可能与其特异性降解PET三聚体或对高分子量PET活性较弱相关。值得注意的是，簇间酶分子量差异显著：簇2酶最小（中位数19.96 kDa），簇1中等（28.55 kDa），簇3最大（34.3 kDa）。高分辨率SSN（≈50%一致性）显示簇1内部分群与分类学类别一致，如放线菌纲和变形菌纲分别形成独立亚簇。系统发育分析进一步证实PETases广泛分布于多个进化分支，但某些特定分支（如放线菌门和变形菌门）存在显著富集现象。这种分布特征表明PET降解能力可能源于酶对天然聚酯的底物广谱性而非强正选择压力，且水平基因转移可能在进化过程中发挥作用。

3 PETase结构高度保守：优化策略趋于一致

除IS11酶属于β-内酰胺酶/转肽酶超家族外，绝大多数PETases采用α/β水解酶（ABH）折叠——酯酶中最常见的结构框架。该超家族以序列和功能多样性著称，且易通过少量突变实现功能转换。PETases通常缺乏额外的结构域（如帽区、盖区或结合域），这可能有利于大体积PET底物接近活性中心。尽管序列一致性较低（54%的酶对低于30%），结构相似性却显著更高（基于Alphafold2模型的LDDT评分验证）。这种结构保守性使得不同PETases间的有益突变可成功移植，例如：将TfCut2的二硫桥引入LCC获得LCC_ICCG；将IsPETase突变灵感应用于PET6野生型；将DuraPETase突变引入LCC-ICCG和PES-H1等。对12个重要工程酶的结构比对揭示多个高频突变位点（如S121、D186、R280等），证实了结构指导的理性设计策略的有效性。

4 实验条件高度可变下的PETase活性比较

由于不同研究中实验条件（底物类型、温度、pH、反应时长）差异显著，直接比较PETases活性面临挑战。通过分析Erickson等人对19种酶的多条件测试数据，发现即使在不同底物和反应时长下，酶活性排名仍呈现合理相关性（Kendall-τ最低为0.47，一致性概率73.5%）。基于最优条件下38种酶的测试结果，筛选出11种高活性酶（约前30%），并通过跨实验对比鉴定出另外9种性能相当的酶。最终确定的20种高活性酶（占数据集20.2%）在系统发育树中分散分布，表明进化起源与高效降解能力无严格关联，且高活性酶可能存在于未被充分探索的分支中。

5 工业级PET酶法回收的工程化策略

PETase工程聚焦两大方向：中温降解（主导策略为IsPETase改造）和高温降解（以LCC系列工程酶为代表）。中温领域的重要进展包括：FAST-PETase（含N233K/R224Q/S121E/D186H/R280A突变）在30°C下96小时对无定形PET膜的降解效率提升约6倍；Z1-PETase（含13个突变及两对二硫键）在30°C下96小时可降解75%无定形PET粉末。中温酶的优势在于支持全细胞催化，例如恶臭假单胞菌工程菌株可将PET单体转化为β-酮己二酸（尼龙前体）或生物塑料，但当前降解速率仍难以满足工业需求。高温降解领域，LCC-ICCG（F243I/D238C/S283C/Y127G）的Tm提升至90.9°C，在72°C下24小时可降解86%无定形消费后PET粉末；最新变体LCC-A2（H218Y/N248D）的Tm达95.25°C，78°C下3.3小时即可降解90%预处理PET。Carbios公司已利用LCC-ICCG变体实现250公斤/日的塑料回收能力，但高结晶度PET降解、中温效率提升及全细胞催化合成高值产物仍是关键挑战。

6 应对PET酶法回收挑战的未来方向

未来研究应聚焦三大方向：首先，攻克结晶性PET降解难题。可借鉴天然纤维素酶复合体（cellulosome）的多酶协同策略，通过融合PETase与MHETase/BHETase（如使用甘氨酸-丝氨酸 linker）或疏水蛋白/碳水化合物结合模块增强底物结合与降解效率。其次，重视酶半衰期优化而非单纯热稳定性提升。研究表明，尽管HotPETase（Tm 82.5°C）在65°C前5小时降解产物量是LCC-ICCG（Tm 90.9°C）的2.2倍，但24小时后后者反超，凸显了半衰期对工业应用的关键影响。第三，理性选择降解温度。接近PET玻璃化转变温度（T_g，本体约65-75°C）可提高链移动性促进降解，但可能引发物理老化导致再结晶。考虑到水分的增塑效应使表面T_g降至45-48°C，在略低于本体T_g的温度下降解可能平衡表面链移动性与本体再结晶矛盾，实现高效解聚。

7 结论

对天然PETases的系统性综述揭示了其多起源进化特征、结构保守性及功能多样性。结构相似性支持跨物种有益突变移植，为理性设计提供基础。活性分布与系统发育无严格关联表明序列非依赖性筛选有望发现新颖高效PETases。PANDA数据库首次整合功能活性数据，为新型酶发现、关键残基识别乃至从头设计PETases提供了宝贵资源。通过多酶协同、半衰期优化及温度精准控制等策略，酶法PET回收有望实现产业化突破。