钙卫蛋白C末端延伸介导锌螯合并调控金黄色葡萄球菌生物量积累的机制研究

本综述深入探讨了钙卫蛋白（CP）通过其独特的S100A9 C末端延伸（尾部）介导锌离子（Zn2+）螯合，并调控金黄色葡萄球菌（S. aureus）生长与生物膜形成的新型机制。研究通过高分辨率X射线晶体结构揭示了Zn2+在CP的His3Asp和His6位点的结合模式，并发现尽管C末端尾部突变不影响锌亲和力，但其缺失显著影响细菌生物量积累，表明CP除金属 sequestration 外还存在其他抗菌途径。这一发现为宿主-微生物界面营养免疫（nutritional immunity）提供了新的分子见解，对开发抗生物膜感染策略具有重要启示。

　　

1 引言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种机会性革兰氏阳性细菌，包括甲氧西林敏感和耐药菌株（MSSA和MRSA），是全球细菌相关发病和死亡的主要原因。该病原体通过黏附、生长、成熟和分散的调控过程聚集成多细胞结构，称为生物膜（biofilms），其由细胞外聚合物（如核酸、蛋白质和多糖）组成，可限制细菌表面暴露于环境压力。一旦形成，生物膜赋予群落对干燥、抗菌剂、剪切力和其他环境胁迫的抗性。

锌离子（Zn²⁺）和其他痕量第一排过渡金属在葡萄球菌生物学和发病机制中起关键作用。因此，先天免疫因子对这些营养金属的螯合在宿主-微生物界面的营养免疫（nutritional immunity）中扮演关键角色。S100A8/S100A9异源二聚体称为钙卫蛋白（calprotectin, CP），占中性粒细胞胞质含量的40%以上，是一种此类因子。CP螯合锌和其他痕量过渡金属，是营养免疫的关键介质。CP的缺失对宿主抵抗多种病原体（包括金黄色葡萄球菌）感染有害。

S100蛋白（包括CP）形成 obligatory 二聚体，许多在 two subunits 界面处包含对称分布的四面体过渡金属结合位点。Zn²⁺和Cu²⁺在这些位点的结合已明确。CP包含一个典型的四面体His₃Asp过渡金属结合位点，由S100A8的His83和His87以及S100A9的His20和Asp30的侧链形成。然而，CP独特之处在于能够以非常高亲和力结合更广泛的过渡金属，这是其独特的八面体结合位点的结果，该位点由六个组氨酸侧链组成：S100A8的His17和His27以及S100A9的His91、His95、His103和His105（His₆位点）。虽然两个位点都以高亲和力结合Zn²⁺和铜，但六配位His₆位点还以高亲和力结合锰（Mn²⁺）、镍（Ni²⁺）和铁（Fe²⁺）离子。His₆位点是S100A9相对于其他S100蛋白的C末端延伸的副产品。这种延伸（称为C末端尾部）为His₆位点贡献两个组氨酸残基（His103和His105）。除了独特的过渡金属结合位点外，C末端尾部还与一系列额外功能有关，包括脂肪酸的结合和运输。CP过渡金属结合的知识基于广泛的生化表征和与Mn²⁺或Ni²⁺在His₆结合位点的晶体结构。然而，尚无CP与Zn²⁺离子结合在任一位点的结构可用。

为了更好地理解CP在调控葡萄球菌生物学和发病机制中的作用，本文报告了CP的Zn²⁺结合及其对金黄色葡萄球菌生长和生物膜形成的影响的研究。X射线晶体结构揭示了Zn²⁺离子如何在两个CP过渡金属结合位点结合，确认了S100A9 C末端尾部在His₆位点中的作用。定点突变和截断突变探索了尾部对Zn结合和抗菌活性的贡献。生长和生物量积累 assays 探究了S100A9 C末端尾部对CP限制金黄色葡萄球菌生长的贡献。这些结果表明CP通过多种机制发挥作用，并非所有机制都依赖于过渡金属螯合。

2 结果

2.1 CP的锌螯合抑制金黄色葡萄球菌生长和生物量积累

痕量过渡金属螯合由CP可对体外和体内细菌生长产生不利影响，但也可作为使病原体逃避营养免疫的金属库。进行生长 assays 以验证先前观察到的钙卫蛋白对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。CP处理营养丰富培养基导致明显的生长缺陷。CP容易形成二硫键交联 oligomers。为了最小化生物物理实验和功能 assays 中的交联，许多研究 incorporate 众所周知的S100A8（C42S）和S100A9（C3S）的Cys-Ser突变。这种CP变体将称为CP。比较在CP与野生型CP存在下生长的 assays 显示无显著差异，验证了这些突变不改变CP对金黄色葡萄球菌的活性。

为了直接测试这种抗菌活性可归因于Zn²⁺螯合的假设，还使用两个先前报道的CP突变体进行了生长 assay：CPH103/104/105N，它能够正常结合Zn²⁺和Cu²⁺，但不能以高亲和力结合Mn²⁺或Fe²⁺，以及CP* ?His₆?His₃Asp，它不能以高亲和力结合任何过渡金属。在8和24小时，失去His₆和His₃Asp位点（CP* ?His₆?His₃Asp）导致仅有限的生长抑制，而CP* H103/104/105N突变体导致 substantial 抑制，尽管未达到CP*的水平。这些数据支持先前的研究，表明过渡金属结合的作用是CP抗菌活性的核心，并且His₃Asp和His₆位点中痕量过渡金属的螯合对观察到的抗葡萄球菌活性至关重要。

2.2 Zn²⁺在His₆位点结合的CP结构

尽管CP螯合锌对抑制微生物生长很重要，但对其两个独特过渡金属结合位点的Zn²⁺结合分子机制的认识缺乏。为了定义CP如何螯合Zn²⁺离子，我们着手确定Ca²⁺加载、Zn²⁺结合的CP的X射线晶体结构。Zn²⁺结合蛋白的结晶非常困难，因Zn²⁺依赖性蛋白质在溶液中聚集而复杂化。通过将Zn²⁺离子浸泡到Ca²⁺加载的CP晶体中和在Zn²⁺离子存在下共结晶来尝试结晶Zn²⁺加载的CP。然而，尽管付出了巨大努力，在缓冲液中包含超过0.7摩尔当量的Zn²⁺会导致沉淀，即使在已知改善S100蛋白溶解度的MgCl₂存在下也是如此。使用动态光散射（DLS）检查不同Zn²⁺浓度下CP的 oligomerization 状态。在无Zn²⁺时，CP显示单分散峰，其自相关函数中的衰减时间表明其主要以四聚体状态存在。然而， upon 引入Zn²⁺，观察到由更高衰减时间指示的高阶 oligomers 群体以及增加的多分散性。这表明CP经历Zn²⁺依赖性 oligomerization 和聚集， presumably 反映了结合Zn²⁺后表面静电学的变化，促进了 oligomerization。

使用亚化学计量水平的Zn²⁺在溶液中成功结晶Zn²⁺结合的CP*，产生衍射至1.87 ?的晶体。数据 refinement 产生了预期的异源二聚体对称二聚体，其中Ca²⁺离子在EF-hand中，Zn²⁺离子结合在两个His₆位点中。整体结构与先前报道的Ca²⁺、Ca²⁺ + Mn²⁺和Ca²⁺ + Ni²⁺状态非常相似， pairwise C_α RMSDs分别为0.18、0.24 ?和0.27 ?。Zn²⁺ occupancy 在四聚体的两个His₆位点中分别为0.51和0.54，反映了缓冲液中亚化学计量水平的Zn²⁺。正如预期，Zn²⁺离子由S100A8的His17和His27的N^ε2原子以及S100A9的His91、His95、His103和His105的N^ε2原子配位。关于配位几何的细节在表中提供。值得注意的是，Zn²⁺离子在His₆位点的结合导致 otherwise 灵活的C末端尾部的结构稳定化以及二聚体界面的增加。

2.3 Zn²⁺在典型His₃Asp位点结合的CP结构

考虑到CP在Zn²⁺存在下的有限溶解度以及观察到的对WT蛋白质的His₆位点的优先结合，我们推理可能通过废除His₆位点的过渡金属结合来获得Zn²⁺离子结合在典型His₃Asp位点的结构。因此，在多种变体上进行了结晶 trials，这些变体用重新设计的CP金属结合位点制备，并在存在2 mM MgCl₂以防止聚集的情况下，向Ca²⁺加载的CP中添加0.7摩尔当量的Zn²⁺。其中，一个在His₃Asp位点携带H87C突变以及ΔHis₆突变的CP*变体结晶，其中Zn²⁺离子结合在His₃Asp位点。晶体衍射至1.74 ?，数据 refinement 产生了预期的四聚体结构。在这种情况下，四聚体内两个His₃Asp位点中仅一个具有显著 occupancy（0.6）的Zn²⁺离子结合。整体结构再次与先前报道的CP结构相似，包括CP与Zn²⁺结合在His₆位点的结构。Ca²⁺离子结合在EF-hand中，Zn²⁺离子由S100A8的His83（N^ε2）和Cys87（S^?1）以及S100A9的His20（N^ε2）和Asp30（O^δ1）配位， thus 形成整体扭曲的四面体几何。

引人注目的是，在该结构中观察到C末端尾部的电子密度直至Gly100。在所有先前的CP结构中，当离子结合在His₆位点时，S100A9的C末端尾部包裹金属离子，并观察到明确定义的电子密度。相反，当无离子结合在His₆位点时，仅观察到直至Glu92的电子密度。因此，这是首次在未参与配位过渡金属时观察到S100A9 C末端尾部密度的例子。这种构象通过晶体接触稳定化，如晶体堆积环境分析所确认。

2.4 His₆位点的高亲和力Zn²⁺结合不需要C末端尾部的His残基

观察到的所有六个组氨酸残基在His₆位点螯合Zn²⁺离子似乎与早期工作不一致，这些工作表明突变C末端尾部的His103和His105不显著改变整体Zn²⁺结合亲和力。为了解决这种明显的不一致，我们转向先前由Nolan和同事应用的竞争螯合剂方法，以更高精度测量CP的Zn²⁺结合参数。两个CP变体用于本研究：H103/104/105N，它突变His103和His105侧链，以及G102Stop，它删除整个C末端尾部。荧光信号浓度依赖性增加拟合到标准结合曲线提供了两个Zn²⁺位点平均的表观K_d（K_dAPP）值：CP（0.16 ± 0.07 pM），CP* H103/104/105N（0.21 ± 0.03 pM），CP* G102Stop（K_d 0.22 ± 0.07 pM），阴性对照CP* ?His₆?His₃Asp（n/a）。这些结果表明，即使缺乏C末端尾部，高亲和力Zn²⁺结合仍保留。然而，由于螯合剂 assay 测量两个结合位点的平均亲和力，它不区分个体贡献。这留下了三个C末端组氨酸残基（His103、His104、His105）对位点特异性Zn²⁺结合的贡献程度的问题，特别是考虑到对His₆位点优先 occupancy 的结构证据。

2.5 S100A9 C末端尾部的修饰减轻其对抗金黄色葡萄球菌的抗菌效果

进行了额外的生长 assays 以确定C末端尾部是否在CP的抗菌活性中具有特定作用。为此分析，比较了在250 μg/mL CP存在下与相应量的CP?His₆?His₃Asp、CP* G102Stop、CP* H103/104/105N或S100A9（对照）存在下金黄色葡萄球菌的生长。正如预期，单独的S100A9与单独缓冲液相比对金黄色葡萄球菌生长的影响最小，而CP处理培养基导致明显的生长和 carrying capacity 缺陷。失去两个过渡金属结合位点（?His₆?His₃Asp）导致观察到的CP处理生长缺陷的显著回复，而H103/104/105N和G102Stop变体导致中间表型。这表明S100A9 C末端尾部及其组氨酸残基显著影响金黄色葡萄球菌生长。

2.6 金黄色葡萄球菌生物量积累受CP变体金属螯合的差异影响

简单的液体生长 assays 在这种情况下不足以明确表征与S100A9 C末端尾部相关的金黄色葡萄球菌生长和发病机制缺陷。由于 adherent 生物量和生物膜形成是决定金黄色葡萄球菌感染结果的临床相关特征，使用结晶紫（CV） assays 量化了细菌群落（adherent 和 nonadherent/planktonic）的分数，此外还有暴露于SYPRO Ruby和DAPI的平行培养物。在12小时静置培养时，观察到 adherent（由结晶紫染色，OD₅₉₅）和 planktonic（可溶性，OD₆₀₀）生物量的差异，与CP的痕量过渡金属结合活性相关。与图1b平行，用CP处理金黄色葡萄球菌培养物导致与S100A9阴性对照相比 planktonic 和 adherent 生物量的显著减少。在用CPH103/104/105N处理的培养物中，其保持结合Zn²⁺和Cu²⁺的能力，但不结合Mn²⁺ nor Fe²⁺，观察到与CP*处理培养物相似的生物量显著减少。在用?His₆?His₃Asp处理的情况下，观察到减少的 planktonic 但非 adherent 生物量，而用G102Stop处理导致既不减少 adherent 也不减少 planktonic 生物量积累。这些数据表明，CP的痕量过渡金属螯合改变了 planktonic 和 adherent 金黄色葡萄球菌生物量的积累，但S100A9 C末端尾部有 distinct 贡献。

Planktonic 和 adherent 生物量由复杂分子组成，包括 intra- 和 extra-cellular DNA、蛋白质和多糖。为了深入了解响应处理的 accrued 生物量的组成，将暴露于CP和其他变体的金黄色葡萄球菌平行培养物分离为 planktonic 和 adherent 分数，并用SYPRO Ruby和DAPI染色。在 adherent 分数中，处理导致总 intra- 和 extra-cellular 蛋白质浓度相似，如SYPRO Ruby染色所量化。然而，与所有其他条件相比，在CP处理培养物中观察到指示DNA丰度统计显著减少的DAPI染色显著减少。相反，尽管用H103/104/105N处理的CV染色显示 adherent 和 planktonic 生物量分数与CP*相似，但SYPRO Ruby和DAPI染色的量显著更高，与S100A9处理培养物相似。已知结晶紫结合细菌生物量的所有主要成分（蛋白质、DNA、脂质和多糖），无论细胞 viability 如何。因此，对H103/104/105N处理观察到的差异可能不反映DNA和总蛋白质的差异，而是可能代表多糖形式的细胞外基质差异。

在 planktonic 分数中，CP*处理培养物 exhibit 低生物量（OD₆₀₀），但高SYPRO Ruby染色和与 other 变体相比 somewhat 更高的DAPI染色DNA含量。由于总生物量捕获的差异不能通过总蛋白质和总DNA的量化完全解释，这些实验表明观察到的生物量差异源于多糖和/或可行细胞含量的差异。

2.7 CP*与金黄色葡萄球菌的相互作用受His₃Asp、His₆和S100A9 C末端尾部的影响

观察到的与S100A9尾部相关的抗菌作用机制可能源于其直接与金黄色葡萄球菌相互作用。为了测试这一假设，测量了接种后12小时CP和总蛋白质含量的差异。正如预期，预接种测量显示添加250 μg/mL蛋白质到培养基中不同样品中蛋白质含量差异很小。多克隆抗S100A8/A9抗体成功检测到这些实验中使用的所有CP蛋白质。G102Stop变体的单一条带观察出现是因为S100A9 C末端尾部的截断导致S100A9亚基具有与S100A8非常相似的质量，导致条带重叠。图4g中?His₆?His₃Asp染色水平较低乍看令人困惑。然而，图4h中的SYPRO Ruby染色表明该蛋白质的量大致相同，这意味着该变体中的突变 ensemble 改变了与抗体的相互作用，导致印迹中 weaker 染色。

测量了接种金黄色葡萄球菌后12小时与细菌生物量相关的蛋白质。加载到每个孔的量标准化，以便染色反映跨条件的蛋白质丰度差异。这种 normalization 通过使用金黄色葡萄球菌表面蛋白质在~50和~37 kDa的非特异性染料/抗体捕获作为生物量报告物，提供了细菌丰度的额外测量。金黄色葡萄球菌产生多种高度丰富的蛋白质，如SpA，其非特异性捕获抗体作为逃避免疫系统的策略。SpA结合免疫球蛋白的Fc区域，因此针对金黄色葡萄球菌裂解物的免疫印迹上“非特异性”条带常见。比较不同处理显示预期趋势，缓冲液 only 对照中最多金黄色葡萄球菌相关蛋白质，CP处理中最少，其他变体介于其间，而免疫印迹强度相对相似。仅对CP观察到总蛋白质含量 substantially 较低表明 both 金属结合（?His₃Asp?His₆）和S100A9 C末端尾部中的残基（H103/104/105N, G102Stop）是与金黄色葡萄球菌相互作用所必需的。

3 讨论

CP的缺失对宿主抵抗多种病原体（包括金黄色葡萄球菌）感染有害。先前对CP对抗金黄色葡萄球菌的抗菌机制的研究 revealed that the binding of Zn²⁺ and Mn²⁺ is essential to its antimicrobial activity，同时 noting other mechanisms contribute。本研究 focused on obtaining a clearer understanding of the Zn²⁺-mediated antimicrobial activity of CP against S. aureus。确定具有结合Zn²⁺离子的CP结构 posed a substantial challenge due to the low solubility of CPupon addition of Zn²⁺，这 required using substoichiometric levels of Zn²⁺ in the crystallization buffers。我们的结构 provided direct confirmation of how Zn²⁺ ions are coordinated in CP's His₃Asp site and showed that all six residues are engaged in the His₆ site。有趣的是，高亲和力Zn²⁺结合在突变His₆位点Zn²⁺配体His103和His105或移除整个S100A9 C末端延伸（尾部）后仍保留。然而，在CP变体存在下生长的详细调查显示金黄色葡萄球菌 adherent 与 nonadherent 分数的生长差异，表明对CP活性的贡献独立于锌螯合。

我们先前表明S100A9 C末端尾部对Mn²⁺结合和CP的抗菌活性 essential，但对Zn²⁺结合不需要。CP的三维结构已确定与Ca²⁺（PDB-1XK4）、Ca²⁺+Mn²⁺（PDB-4GGF）和Ca²⁺+Ni²⁺（PDB-6DS2），但直到本文报道的那些之前，无与Zn²⁺离子结合的结构。我们确定的结构在整体架构上与先前报道的相似。然而，令人惊讶的是，在我们具有Zn²⁺结合在典型His₃Asp位点的CP* ?His₆H87C结构中，我们观察到S100A9 C末端尾部的明确定义电子密度。尾部在溶液中已知灵活，并在所有先前获得的无金属离子结合在His6位点的CP结构中无序。然而，晶体堆积的仔细检查导致了 unique 晶体接触的发现，这些接触 presumably 稳定了该晶体形式中的C末端尾部。

具有结合Zn²⁺离子的CP结构 revealed hexacoordinate Zn²⁺ binding in the His₆ site as is observed for Mn²⁺ and Ni²⁺。然而，我们 confirm that only four of the six His residues in the His₆ site are required for high-affinity Zn²⁺ binding in vitro。溶液中获得的Zn²⁺结合曲线显示CP中的两个过渡金属结合位点不可区分。那么为什么在具有亚化学计量水平Zn²⁺获得的CP结构中His₆位点被占用而His₃Asp位点未被占用？我们将此观察归因于一种物种相对于另一种物种的优先结晶，即两种半Zn²⁺加载状态在溶液中平衡存在，但结晶更容易发生在具有Zn²⁺离子在His₆位点而非His₃Asp位点的物种中。

我们的功能 assays 与过去报告一致，即金属对金黄色葡萄球菌生长核心。虽然CP严重限制金黄色葡萄球菌生长跨越24小时培养，但具有His103、His104和His105突变的变体影响较小，而敲除 both His₃Asp and His₆位点导致仅轻微减少金黄色葡萄球菌生长。Adherent 和 nonadherent 金黄色葡萄球菌培养分数的测量表明，金黄色葡萄球菌生物量积累受CP处理影响最大，相对于His103/104/105变体和具有S100A9尾部截断的变体（G102Stop）。特别是，使用G102Stop或H103/104/105N处理培养物的生物量积累研究 exhibit 不同的 planktonic 和 adherent 生物量模式。例如，用G102Stop突变体处理导致生物量增加，甚至比?His₆?His₃Asp突变体更多。这些差异存在于图4a,d的总生物量测量中，并与总蛋白质（图4b,e）和总DNA（图4c,f）的分析一致。从这些分析中，adherent 生物量在这些短时间点与总生物量的约10%相关，与生物膜生命周期模型一致。S100A9尾部的缺失也与减少的金黄色葡萄球菌结合相关，类似于失去 both His₃Asp and His₆过渡金属结合位点。因此，虽然CP的一些效应通过突变His103、His104和His105减少，但CP尾部中的剩余残基对金黄色葡萄球菌生物学和发病机制有 clear 影响。

观察到的 upon deletion of the S100A9 C-terminal tail 的 distinct 表型需要进一步研究CP介导金黄色葡萄球菌病理学的生化和微生物学机制。 collectively，我们的结果揭示了S100A9 C末端尾部在宿主-微生物界面CP结合Zn²⁺中的重要性，并表明尾部在生物膜形成和生物量积累中的额外作用独立于其金属结合活性， potentially 与该蛋白质区域和金黄色葡萄球菌之间的相互作用相关。