单个残基Thr274调控短乳杆菌GH43家族β-1,4-木糖苷酶四聚体结构与动力学的分子机制研究

本刊推荐：本研究解析了短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）来源的GH43家族β-木糖苷酶（LbXyn43B）的1.9?高分辨率晶体结构，首次发现其四聚体组装模式。通过分子动力学模拟和定点突变（Thr274Ala），揭示单个界面残基通过调控四聚体紧凑性影响酶的热稳定性和底物可及性。该工作为寡聚酶的结构动态调控提供了新见解，对开发高效木质纤维素转化酶具有重要指导意义。

　　

引言

木质纤维素材料作为高附加值产品的原料日益受到关注，其中木寡糖（XOS）作为益生元化合物备受重视。短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）DSM1269作为益生菌，其生长受到XOS的显著促进。本研究聚焦于该菌株胞内GH43家族β-木糖苷酶LbXyn43B的结构与功能解析。

材料与方法

通过基因克隆技术在Escherichia coli BL21(DE3)中表达重组酶，采用 immobilized-metal ion affinity chromatography (IMAC) 进行纯化。利用 size exclusion chromatography (SEC) 和 multi-detection size exclusion chromatography (OMNISEC) 分析寡聚状态，通过 differential scanning fluorimetry (DSF) 测定热稳定性。晶体结构通过分子置换法解析，分子动力学模拟采用 GROMACS 软件包运行300 ns。

结果

生物信息学分析

LbXyn43B与短乳杆菌其他菌株同源酶存在5个氨基酸差异，其中Thr274位于亚基界面 loop 区域。AlphaFold3 结构预测表明该残基可能影响四聚体组装。

蛋白生产与验证

重组酶和 Thr274Ala 突变体均获得>95%纯度，肽质量指纹谱证实突变成功。BL21(DE3)宿主产量最高（0.65 g/L），突变体热稳定性提升（T_m提高1.1°C）。

寡聚状态分析

SEC初步显示突变体表观分子量降低，但OMNISEC证实两者均以四聚体为主（91.3%）。突变体 hydrodynamic radius (R_hw) 从5.31 nm降至4.91 nm，intrinsic viscosity (IVw) 降低，表明结构更紧凑。

晶体结构解析

1.9?分辨率结构（PDB: 9HE8）显示典型的GH43家族折叠：N端催化结构域呈5叶β-螺旋桨，C端β-三明治结构域通过柔性 loop (Ala318-Ser332) 连接。四聚体通过二聚体对形成，界面 loop (Ser269-Arg290) 中的Thr274参与亚基相互作用。

分子动力学模拟

300 ns模拟显示突变体 root mean square deviation (RMSD) 稳定在0.3-0.4 nm，而野生型在280 ns后升至0.7 nm（部分解离为二聚体）。突变体 radius of gyration (R_g) 稳定在3.9 nm，野生型从4.0 nm增至4.15 nm，证实突变增强四聚体稳定性。

催化特性

酶优先作用于短链XOS底物：xylobiose (X2) 的 k_cat/K_m 为41.2 mM^-1s^-1，xylotriose (X3) 为36.6 mM^-1s^-1。Thr274Ala突变对X4的 k_cat 影响显著（150.0 vs 127.6 s^-1），表明长链底物可及性受四聚体形状调控。活性中心催化三联体（Asp14/Asp127/Glu187）高度保守，通过氢键和疏水相互作用结合底物。

讨论

本研究首次报道LAB来源GH43_11亚家族木糖苷酶的晶体结构。与 Bacillus pumilus 来源酶（PDB: 5ZQS）的叠加显示底物结合模式保守。Thr274Ala突变通过减少空间位阻和增强疏水作用稳定四聚体，解释了同源酶XynB2（DSM20054菌株）SEC显示二聚体的现象。酶对X2/X3的偏好性与菌株利用这些底物生长的生理数据一致。

结论

LbXyn43B负责短乳杆菌DSM1269胞内XOS代谢的起始步骤。单个残基突变（Thr274Ala）通过改变四聚体形状而非寡聚状态，影响酶的热稳定性和底物可及性。该发现为寡聚酶的结构调控提供了新模式，在木质纤维素生物炼制和益生元开发中具有应用潜力。