理性设计共价ACE2诱饵受体以广谱中和SARS-CoV-2变异株

本综述系统阐述了通过理性设计策略开发共价ACE2-Fc诱饵受体的突破性进展。研究整合功能基因组学与结构信息，靶向SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）受体结合域（RBD）中进化保守的酪氨酸473（Y473），通过非经典氨基酸氟硫酸酪氨酸（FSY）的位点特异性掺入，成功构建了E23FSY/T27FSY突变体。该诱饵受体通过硫氟交换（SuFEx）化学实现与病毒RBD的不可逆结合，对野生型（WT）及奥密克戎（Omicron）BA.1/BA.5等变异株均展现出显著增强的中和活性，为应对病毒逃逸提供了全新解决方案。

　　

1 引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起，全球死亡人数已超700万。病毒表面的刺突蛋白（S蛋白）三聚体是主要抗原位点，其受体结合域（RBD）与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的特异性结合是病毒入侵的关键步骤。尽管mRNA疫苗和中和抗体疗法快速发展，但病毒持续进化产生的关切变异株（VOCs）导致免疫逃逸，对公共卫生构成持续挑战。

可溶性ACE2（sACE2）诱饵受体是一种替代策略，其优势在于病毒若要逃逸诱饵受体，必然同时丧失与内源性ACE2的结合能力。然而野生型ACE2与RBD的亲和力较低（解离常数K_d为15-50 nM），限制了其治疗潜力。通过深度突变扫描、计算设计和定向进化等技术，ACE2-Fc的结合亲和力已提升至亚纳摩尔水平，但其结合仍为可逆性，需高浓度维持中和效果。

为解决该局限，研究者开发了基于邻近启动力学（proximity-enabled chemistry）的共价结合策略。通过遗传密码扩展技术掺入携带生物反应基团的非经典氨基酸（ncAA），如氟硫酸-L-酪氨酸（FSY），其氟硫酸基团可与靶蛋白上的组氨酸、赖氨酸或酪氨酸通过硫氟交换（SuFEx）反应形成稳定共价键。该策略已应用于抗RBD的微型结合蛋白（minibinder）和纳米抗体，但效果受限于支架蛋白的非共价结合亲和力——当靶向突变频繁的残基（如K417）时，Beta和Omicron变异株的K417N突变会导致共价捕获完全失效。本研究旨在结合突变抗性的天然受体支架与结构引导的FSY位点特异性掺入，开发广谱中和的共价ACE2-Fc诱饵。

2 结果

2.1 酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）变体比吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）系统更高效掺入FSY

FSY此前主要通过^MmPylRS变体及其配套tRNA进行位点特异性掺入，但效率相对较低。鉴于FSY是对位取代的苯丙氨酸衍生物，本研究测试了^EcTyrRS变体（AcFRS、AzFRS、pBpaRS）对FSY的识别能力。将含琥珀终止密码子（E33UAG）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因与各氨基酸酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对共表达于293c18细胞，添加1 mM FSY后通过荧光强度评估掺入效率。结果显示AcFRS/tRNA^Tyr_CUA对的掺入效率达8.8%±1.3%，显著高于FSYRS/tRNA^Pyl_CUA对的3.8%±0.9%（p<0.05），故后续实验选择AcFRS系统。

2.2 设计ACE2-Fc的FSY掺入位点以靶向RBD上的保守亲核残基

FSY可与组氨酸、赖氨酸和酪氨酸形成共价键。为开发广谱中和的FSY掺入ACE2-Fc突变体，需靶向RBD上功能受限且不易突变的亲核残基。基于ACE2-RBD复合物晶体结构（PDB: 7KMB），初选六个候选残基：K417、Y449、Y453、Y473、Y489和K458。

通过深度突变扫描（DMS）数据评估突变约束性，以有效氨基酸数（n-effective）表示（值越低表明进化约束越强）。Y449、Y473和Y489的n-effective值最低，功能约束最强；全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）数据库分析显示这些残基在真实世界的突变频率极低（<0.05%），而K417因Beta/Omicron变体的K417N突变频率高达49.35%。结合高功能约束和低突变频率，最终选择Y449、Y473和Y489作为广谱中和的理想靶点。

随后确定ACE2-Fc上的FSY掺入位点。SuFEx反应要求FSY的β碳与亲核原子（氮/氧）距离在约8.2 ?内。基于复合物结构，筛选出八个可能位点：E23、T27、D30、K31、H34、Y41、Q42和L79，其β碳与目标亲核原子的距离均小于9 ?。

2.3 FSY掺入ACE2-Fc与SARS-CoV-2 S蛋白的交叉连接

将含琥珀密码子的ACE2-Fc突变体质粒与AcFRS/tRNA^Tyr_CUA对共转染293c18细胞，在含1 mM FSY的培养液中表达蛋白。通过蛋白G磁珠捕获ACE2-Fc，与过量His标签RBD（RBD-His）孵育后 western blot 分析。结果显示E23FSY、T27FSY、D30FSY、K31FSY、H34FSY和Q42FSY均产生约160 kDa的共价交联产物（ACE2-Fc单体约120 kDa，RBD约35 kDa），其中E23FSY、T27FSY和H34FSY的交联效率最高（分别为82%、66%和57%）。

在含10%或50%胎牛血清（FBS）的条件下，E23FSY和T27FSY仍能与RBD特异性交联，无明显非特异性反应。使用三聚化S蛋白胞外域（S-foldon）进行实验，FSY掺入突变体均产生>235 kDa的高分子条带，对应ACE2-Fc与S蛋白单体的1:1共价复合物，证明FSY介导的交联在完整三聚体S蛋白背景下仍有效。

2.4 E23FSY和T27FSY突变体通过靶向高度保守的Y473共价捕获Omicron RBD

为确定FSY的靶向残基，制备了RBD点突变体（K417N、K458N、K458R、K458H、Y473F、Y489F）。交联实验显示E23FSY和T27FSY与所有突变体均能交联，唯独Y473F突变体交联显著减弱；H34FSY则仅不能与K417N突变体交联。表明E23FSY/T27FSY靶向Y473，而H34FSY靶向K417，与结构预测一致。

奥密克戎变异株RBD（如BA.5）常携带K417N突变，但Y473高度保守。分析BA.5 RBD与ACE2的复合物结构（PDB: 7WPB）发现Y473的氧原子（Oη）与ACE2上E23和T27的β碳距离分别为7.7 ?和5.3 ?，处于SuFEx反应范围内。Western blot证实E23FSY和T27FSY对Omicron BA.5 RBD的交联效率与野生型相当，而H34FSY完全失效，凸显靶向保守残基的优势。

2.5 FSY包含ACE2-Fc与RBD交联反应的动力学

将含ACE2-Fc突变体的细胞上清（约2.5 nM）与25 nM RBD-His在37°C孵育，时间梯度分析交联过程。针对野生型RBD，E23FSY和T27FSY在0.5-2小时内达到最大交联，H34FSY反应较慢，4小时后才检测到产物；针对Omicron BA.5 RBD，E23FSY/T27FSY在0.25-1小时内即达最大效率，H34FSY在20小时内无任何交联产物，与之前结果一致。

2.6 病毒感染中和

通过假病毒中和实验评估先导突变体的中和能力。使用携带D614G（野生型样）或Omicron BA.1 S蛋白的假病毒，预孵育后感染表达TMPRSS2的VeroE6细胞，通过荧光素酶活性量化病毒进入。

针对D614G假病毒，E23FSY在最低测试浓度（0.1 ng/μL）即有效抑制，T27FSY在3.0 ng/μL有效，而非共价WT ACE2-Fc和H34FSY无显著活性；针对Omicron BA.1假病毒，E23FSY和T27FSY分别在0.1 ng/μL和0.3 ng/μL显著降低病毒进入，WT ACE2-Fc仅在最高浓度（3.0 ng/μL）有微弱活性，H34FSY完全无效。证明靶向Y473的共价诱饵受体具有显著增强的广谱中和活性。

3 讨论

本研究成功开发出能高效中和多种SARS-CoV-2变异株的共价ACE2-Fc诱饵受体。通过整合功能基因组学与结构数据，理性选择保守残基Y473作为共价靶点，构建的E23FSY/T27FSY突变体表现出快速特异的交联能力和显著增强的中和活性。

与靶向K417的策略相比，本研究靶向进化约束残基避免了变异株逃逸问题。共价结合的优势在于不可逆性，克服了可逆结合剂需维持高浓度的局限。相较于纳米抗体等人工支架，ACE2天然受体平台具有显著优势：其一，设计过程可直接利用已公开的ACE2-RBD复合物结构，无需针对每个新支架解析晶体结构；其二，天然互作界面更大，提供更多可靶向的亲核残基，增加成功概率。

近期研究报道了在细胞膜ACE2的E23位掺入FSY的囊泡，能共价捕获野生型和Omicron RBD，通过吸入剂形式降低动物死亡率，与本研究的ACE2(E23FSY)-Fc结果一致。表明靶向突变约束残基的策略对开发广谱共价抗病毒药物具有重要价值。

研究存在一定局限性：中和实验使用假病毒，需在真实病毒和体内模型验证；哺乳细胞表达FSY掺入蛋白产量较低（亚微克级/10 cm培养皿），需开发稳定高产细胞系；Y473在SARS-CoV中为苯丙氨酸，且某些沙贝病毒中缺失，故跨物种应用需谨慎选择保守残基。

4 材料与方法

4.1 质粒

使用含EB病毒复制起点的pOriP载体在293c18细胞中实现高水平基因表达。构建含琥珀密码子（UAG）的EGFP和ACE2-Fc突变体质粒，以及各类aaRS/tRNA表达质粒（如AcFRS/tRNA^Tyr_CUA）。点突变通过定点突变产生。

4.2 哺乳细胞中FSY掺入EGFP

将含E33UAG的EGFP报告基因与各aaRS/tRNA对共转染293c18细胞，在含1 mM FSY的无血清培养基中培养，裂解细胞后通过荧光强度评估FSY掺入效率。

4.3 His标签RBD和S蛋白的表达纯化

小规模制备：转染293c18细胞，收集上清后通过Ni磁珠纯化RBD-His突变体；大规模制备：用Expi293F细胞表达，经Ni柱和尺寸排阻色谱纯化。

4.4 ACE2-Fc构件的表达纯化

共转染ACE2-Fc(UAG)突变体质粒与AcFRS/tRNA^Tyr_CUA对，在含1 mM FSY的培养基中表达，通过蛋白G磁珠或Ni磁珠纯化蛋白。

4.5 交联实验

分为磁珠上交联（ACE2-Fc先固定）和溶液中交联（直接混合孵育）两种形式。与RBD-His或S-foldon孵育后， western blot 分析交联产物。

4.6 假病毒中和实验

将假病毒与系列浓度ACE2-Fc突变体预孵育后感染VeroE6/TMPRSS2细胞，48小时后检测荧光素酶活性评估中和效果。

4.7 统计学分析

使用Prism 10软件进行单因素方差分析及Tukey-Kramer或Dunnett's检验，p<0.05视为显著。