新型PCR-毛细管电泳检测技术实现FMR1 CGG重复序列高精度检测：一项多中心评估研究

为解决脆性X综合征（FXS）分子诊断中低DNA输入和低水平嵌合体检测灵敏度不足的问题，研究人员开发了一种新型四引物PCR-毛细管电泳检测技术（FP-PCR/CE）。该研究通过多中心临床样本验证表明，该方法在CGG重复序列定量、嵌合体检测和AGG中断分析方面均优于现有技术，检测灵敏度达1%嵌合水平和2.5 ng/μL DNA输入量，同时将检测时间缩短至7小时以内，成本降低至80美元/测试，为FXS的精准诊断和遗传咨询提供了重要技术支撑。

脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）作为最常见的遗传性智力障碍疾病，也是自闭症谱系障碍的主要单基因致病因素，其分子机制源于X染色体上FMR1基因5'非翻译区（5' UTR）的CGG三核苷酸重复异常扩增。正常等位基因的CGG重复次数为5-44次，中间型（Intermediate, IM）为45-54次，前突变（Premutation, PM）为55-200次，而全突变（Full Mutation, FM）则超过200次。前突变携带者虽不表现出FXS，但面临卵巢功能早衰和震颤/共济失调综合征的风险，且可能将全突变传递给后代。目前FXS尚无根治方法，早期筛查和遗传干预成为降低发病率的关键。

现有诊断技术中，Southern blot虽曾被视为金标准，但耗时长、需大量DNA且分辨率有限；传统PCR难以扩增高GC富集区；长读长测序技术成本高昂且数据分析复杂。目前最广泛使用的三重重复引物PCR（TP-PCR）技术，例如已获FDA批准的AmplideX试剂盒，仍存在明显局限：其对DNA输入浓度要求较高（≥10 ng/μL），对低水平嵌合体（<5%）检测能力不足，可能导致漏诊或延误诊断，增加患者家庭和社会负担。

为突破这些技术瓶颈，来自浙江大学医学院附属儿童医院、济南市妇幼保健院、湖南省儿童医院等多家医疗中心的研究团队联合开发了一种新型四引物PCR-毛细管电泳检测技术（Four-primer PCR with capillary electrophoresis assay, FP-PCR/CE），并在《World Journal of Pediatrics》发表了其多中心评估研究成果。

该研究采用了以下关键技术方法：首先基于专利设计的四引物系统（中国专利号2019105488480）建立FP-PCR扩增体系，其中包含靶向CGG重复区域上下游序列的引物、随机结合CGG重复区的第三引物以及平衡扩增的第四引物；使用来自世界卫生组织（WHO）、中国食药检研究院（NIFDC）和美国Coriell研究所的DNA标准品进行分析方法验证；收集来自六家医疗中心的1690例临床样本进行多中心验证，并与AmplideX试剂盒及Southern blot进行对比分析；通过系列稀释实验确定检测限（DNA输入≥2.5 ng/μL，嵌合体检测灵敏度达1%质量分数）；利用毛细管电泳平台（Applied Biosystems 3500Dx）进行片段分析，使用GeneMapper或BioFast GenoAnalyzer软件进行CGG重复次数定量。

分析性能验证结果显示，FP-PCR/CE对所有国际DNA标准品的CGG重复次数判定均达到100%准确，包括正确识别NIFDC嵌合样本P11/P12中的87和>200次重复等位基因。在检测限实验中，该技术在DNA浓度低至2.5 ng/μL时仍能稳定检测（图2b），并能准确识别质量分数低至1%的嵌合等位基因（图2c）。与AmplideX试剂的比较分析显示两者基因分型结果完全一致（κ=1.0），Southern blot验证进一步证实了其对PM和FM等位基因的检测可靠性。

临床验证研究纳入1690例参与者（男性717例，女性973例，年龄1-88岁，中位25岁），包括FXS患者、发育迟缓、自闭症谱系障碍、卵巢功能异常及不孕症等多类人群（表1）。FP-PCR/CE与AmplideX assay对所有样本的FMR1等位基因分型结果完全一致（κ=1.0）：正常型（NOR）1519例（89.88%），中间型（IM）9例（0.53%），前突变（PM）46例（2.73%），全突变（FM）116例（6.86%）。所有PM/FM样本及81例随机选择的NOR/IM样本经Southern blot验证，结果与FP-PCR/CE完全一致（κ=1.0）。

在嵌合体检测灵敏度方面，FP-PCR/CE表现出显著优势。在116例FM临床样本中，AmplideX CGG RP PCR仅检测到46例嵌合体，而FP-PCR/CE检测到59例，多发现13例嵌合病例。对这13例样本采用AmplideX Gene-specific PCR（排除CGG特异性引物）复测，结果与FP-PCR/CE完全一致（表3）。典型案例如样本BFXS01086：FP-PCR/CE清晰显示出157、187和>200次重复的三个峰值，而AmplideX CGG RP PCR仅检测到>200次重复的单一峰值，Gene-specific PCR复测则验证了FP-PCR/CE的结果（图3a），Southern blot也证实了该样本的嵌合状态（图3b）。

AGG中断分析能力评估显示，FP-PCR/CE在25个FXS家系（122例样本）中检测AGG中断模式的表现与AmplideX相当（图3c）。家系分析显示，所有24个缺乏AGG中断的亲本PM等位基因在传代过程中均出现CGG扩增，其中87.5%（21/24）进展为全突变（补充表8），证实了AGG中断对维持CGG重复稳定性的重要作用。

该研究的讨论部分强调，FP-PCR/CE技术的优势源于其精心优化的四引物系统：第一、二引物分别靶向CGG重复区域上下游序列，扩增FMR1 5' UTR片段；第三引物随机结合CGG重复区，产生3 bp间隔的"阶梯"峰，实现对每个突变等位基因的追踪；第四引物与其他三引物结合，确保FMR1 5' UTR产物和CGG阶梯峰的平衡扩增。关键的是，第三引物的浓度比其他引物低1000倍以上（补充图3），显著减少了阶梯峰对突变峰信号的干扰，提高对长CGG重复序列的检测灵敏度。

与现有技术相比，FP-PCR/CE具有三大改进：检测灵敏度高（DNA输入≥2.5 ng/μL，嵌合体检测达1%质量分数）；操作效率显著提升（总检测时间<7小时，成本<80美元/测试）；临床实用性更强。该技术已成为中国国家药品监督管理局（NMPA）批准的首个FXS辅助诊断检测方法（注册号20243400096）。

研究也指出了当前技术的局限性：FMR1引物结合区的罕见变异可能影响扩增效率，需要二次确认；当前版本不能评估FMR1甲基化状态，而对PM和FM携带者，甲基化状态与临床预后密切相关。研究团队表示，未来将开发整合甲基化分析功能的增强版本，并提供更全面的诊断信息。

值得注意的是，这种四引物技术是一个通用平台，可适配于多种重复扩增疾病诊断，已在强直性肌营养不良1/2型、脊髓小脑共济失调、Fuchs角膜内皮营养不良和神经元核内包涵体病等疾病诊断中取得进展。研究者相信，这项技术为重复扩增疾病的诊断和管理提供了高效、精准的平台，具有重要的临床推广价值。

该研究得到浙江省重点研发计划（2023C03003）、国家自然科学基金（82373971）和国家重点研发计划（2023YFC2706100）的资助，并遵循临床试验质量管理规范（GCP）标准。所有参与机构伦理委员会批准本研究，临床试验注册号为ChiCTR2500102175。