硒纳米粒子亚化学计量抑制亨廷顿蛋白外显子1聚集的动力学机制研究

本刊推荐：本文深入探究了硒纳米粒子（SeNP）对亨廷顿蛋白外显子1（httex1）聚集的亚化学计量抑制机制。通过NMR光谱、荧光免疫染色和透射电镜等技术，揭示SeNP以纳摩尔亲和力选择性结合延伸活性物种（P）的末端，显著延缓纤维形成。该研究为神经退行性疾病（如亨廷顿病）的纳米治疗策略提供了关键分子见解和潜在应用前景。

　　

引言

亨廷顿病是一种致命的常染色体显性神经退行性疾病，由HTT基因外显子1中CAG三核苷酸重复扩增引起，编码亨廷顿蛋白外显子1（htt^ex1）。当多聚谷氨酰胺（polyQ）区域超过约35个残基时，htt^ex1纤维在神经元内积累，导致疾病发生。htt^ex1包含三个区域：17个残基的两亲性N端（NT）结构域、可变长度的polyQ重复（Q_n）和富含脯氨酸的结构域（PRD）。尽管htt^ex1纤维的原子分辨率结构尚未确定，但固态NMR光谱、电子顺磁共振光谱、冷冻电子断层扫描和冷冻电子显微镜研究表明，纤维核心由polyQ区域形成的刚性β-发夹/β-片层组成，而动态中间的NT螺旋和高度移动的PRD结构域位于纤维外部。

近年来，硒纳米粒子（SeNP）在神经退行性病变中显示出保护作用。本研究旨在探索SeNP调节htt^ex1聚集的机制基础，使用两个htt^ex1蛋白构建体：htt^ex1Q₇和htt^ex1Q₃₅，分别包含7和35个谷氨酰胺重复。htt^ex1Q₇发生瞬时预成核四聚化，但在数周内主要保持单体状态，而htt^ex1Q₃₅在几小时内形成纤维。

结果

通过NMR跟踪htt^ex1Q₃₅的聚集

htt^ex1Q₃₅的聚集/纤维化通过采集一系列2D ¹H-¹⁵N相关光谱并监测htt^ex1Q_{35单体（约11.5 kDa）的消失来跟踪，通过¹HN/¹⁵N交叉峰减少来量化。在5°C下，无SeNP时，初始浓度为300 μM的htt^ex1Q35单体的半衰期（t1/2）约为15小时，而在存在8 mg ml^?1（42 nM）SeNP悬浮液时增加至约20小时。}

使用暗态交换饱和转移（DEST）研究SeNP与htt^ex1Q₇单体的相互作用

为了探索SeNP减缓htt^ex1Q₃₅聚集的机制，首先研究了150 μM ¹⁵N标记的htt^ex1Q₇（约7.4 kDa）与8 mg ml^?1（42 nM）SeNP悬浮液的相互作用，使用¹⁵N-DEST和寿命线宽（¹⁵N-ΔR₂）NMR测量。结果表明，htt^ex1Q₇与SeNP的相互作用仅限于NT区域，而PRD未显示寿命线宽化。全局拟合¹⁵N-DEST谱和¹⁵N-ΔR₂数据到一个两站点交换模型，得出结合种群p_B约为0.2%，表观结合速率常数k_on^app和k_off分别为5.4 ± 0.1和2400 ± 100 s^?1，对应相对较弱的结合，表观平衡解离常数K_diss约为20 μM。

SeNP存在下htt^ex1Q₃₅聚集动力学的定量分析

对300 μM htt^ex1Q₃₅在5°C下无和有8 mg ml^?1 SeNP时的聚集动力学进行定量分析。无SeNP时，实验单体衰减与模拟曲线高度一致，使用先前发布的四聚化平衡关联常数（K_tet = 7.4 × 10⁶ M^?3）和速率常数（k_C = 0.07 h^?1，k₊ = 6.4 × 10⁵ M^?1 h^?1，k_S = 0.3 M^?1 h^?1）进行模拟。SeNP存在下的衰减可通过SeNP与纤维末端P的纳摩尔亲和力结合来解释，表观平衡解离常数K_diss^P为10.2 ± 2.1 nM。类似的最佳拟合也可通过SeNP与预成核四聚体T的纳摩尔结合获得，K_diss^T为8.2 ± 1.5 nM，但该机制与DLS测量、荧光免疫染色和电子显微镜结果不一致。

通过荧光免疫序列光谱和TEM可视化SeNP与纤维末端P的相互作用

使用MW8原发性单克隆抗体（mAb）和Atto-594标记的二级抗体，通过荧光免疫显微镜检查SeNP与300 μM htt^ex1Q₇或htt^ex1Q₃₅的相互作用。结果显示，SeNP与htt^ex1Q₇孵育后无荧光共定位，表明单体或四聚体未紧密结合SeNP。相反，SeNP与htt^ex1Q₃₅孵育40小时后（单体完全消失），显示强烈的荧光信号共定位SeNP。成熟htt^ex1Q₃₅纤维与SeNP孵育无共定位，表明SeNP紧密结合较大的htt^ex1Q₃₅寡聚物种的延伸末端P，而非成熟纤维表面。

负染色TEM进一步支持延伸末端P与SeNP的结合，显示SeNP表面被大的寡聚物种覆盖，呈现为白色斑块。这些斑块形态不同于纤维，对应聚集倾向的延伸末端。分析最亮、定位良好的白色斑块，长度范围约50至120 ?，推测每个SeNP结合寡聚物中的平均单体单元数约为12至25。

结论

本研究表明，htt^ex1Q₃₅的延伸活性末端或核P以纳摩尔亲和力结合SeNP表面，减少自由延伸末端P的池，从而减缓后续纤维化。SeNP与htt^ex1蛋白的相互作用方式不同于其他纳米粒子，如TiO₂纳米粒子短暂结合NT结构域并氧化Met⁷侧链，或脂质纳米粒子隔离htt^ex1单体。

延伸末端P在结构上不同于预成核四聚体T。在后者中，NT区域形成四螺旋束，而polyQ和PRD区域保持无序。具有延伸末端P的物种可能包含与成熟纤维相同或类似的结构，具有刚性的polyQ核心，由重复的β-发夹/β-片层组成，部分移动的NT螺旋和高度移动的PRD结构域位于外部。推测SeNP表面由于其化学和表面电荷，优先与延伸末端P相互作用，后者提供适当的静电和疏水部分以介导纳摩尔结合。

鉴于SeNP能够穿越血脑屏障，与htt^ex1蛋白核和延伸活性末端的复合物可能通过自噬进行细胞降解，如同其他纳米粒子观察到的，从而为亨廷顿病的治疗提供潜在的神经保护途径。尽管当前工作不能直接转化为细胞系统，但它为合理设计和靶向开发可能减少或抑制异常htt^ex1聚集的纳米粒子提供了机制基础。