糖簇化效应揭示：高效合成驱动MUC5AC肽链刚性化的结构机制

本刊推荐：本研究通过创新性开发DMF-free全自动固相合成策略（SPPS），结合1,3-二氧戊环（DOL）/Tween-20溶剂体系与二硒化物-硒酯连接（DSL）技术，首次实现MUC5AC多串联重复肽的极限糖簇化修饰（最高30个GalNAc）。圆二色谱（CD）与脉冲电子双共振（PELDOR）证明α-O-半乳糖胺化（GalNAcylation）通过诱导多脯氨酸II型螺旋（PPII）构象显著增强肽骨架刚性，为黏膜糖蛋白功能研究提供分子基础。

　　

引言背景

黏蛋白糖蛋白是上皮细胞保护层黏液的关键组分，其独特之处在于富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸串联重复序列（PTS结构域）。这些区域是O-糖基化的主要位点，并形成延伸的棒状结构。糖基化被认为对水凝胶化至关重要，O-连接聚糖形成"瓶刷"结构，保护黏蛋白免受蛋白酶水解并防止其坍缩成紧凑结构。尽管核磁共振（NMR）研究已证实α-O-半乳糖胺化对稳定肽骨架延伸构象的作用，但基于短肽（6-10个氨基酸）的研究结论在延伸至多串联重复结构时需要谨慎对待。

合成方法突破

研究团队开发了无需二甲基甲酰胺（DMF）的全自动固相合成新策略。通过使用1,3-二氧戊环（DOL）作为替代溶剂并在所有步骤中添加1% Tween-20，实现了仅用0.5当量过量即可在室温下快速耦合GalNAc化氨基酸。该方法成功合成长度达五个串联重复的MUC5AC糖肽，包含最多30个GalNAc残基（潜在糖基化位点100%占据）。对于更长的糖肽，采用二硒化物-硒酯连接（DSL）和选择性脱硒化策略，在末端半胱氨酸存在下实现了高效连接。

结构表征发现

圆二色谱（CD）分析显示，渐进式GalNAc化使构象平衡从无规卷曲向延伸的多脯氨酸II型螺旋（PPII）转变。当每个八肽重复单元中有四个苏氨酸被GalNAc化时，218 nm处的正峰显著增强，表明PPII构象稳定化。有趣的是，丝氨酸的GalNAc化并不能像苏氨酸那样有效稳定PPII构象，这可能与苏氨酸β-甲基基团对构象空间的限制作用有关。

纳米级刚性测量

脉冲电子-电子双共振（PELDOR）光谱测量揭示了糖基化对肽骨架刚性的显著影响。未糖基化肽的末端距离分布范围广泛，表明构象灵活性高。引入每个串联重复两个GalNAc残基后，距离分布整体向更长距离移动。当每个重复单元有四个苏氨酸被GalNAc化时，肽末端采用小于5 nm距离的倾向性明显降低，主要峰集中在7 nm附近，表明刚性显著增加。完全GalNAc化的肽（每个重复单元六个GalNAc）与仅苏氨酸GalNAc化的肽具有相似的距离分布，表明苏氨酸的GalNAc化是诱导刚性的关键。

生物学意义讨论

研究发现67%的潜在糖基化位点占据（即每个APTTSTTS八肽重复中四个苏氨酸的GalNAc化）足以使MUC5AC肽骨架刚性化。完全GalNAc化诱导的螺旋上升约为每个氨基酸2.5 ?，与寡脯氨酸的测量值相当。这表明复杂的寡糖结构并非肽骨架刚性化的先决条件，简单的GalNAc单糖修饰已足够。这一发现对理解黏蛋白的生理功能具有重要意义，因为天然黏蛋白中GalNAc核心通常还会附加更多的糖基。

技术应用前景

本研究建立的合成方法为制备定义明确的黏蛋白样材料提供了新途径，这些材料可用于免疫学研究、材料科学和生物医学应用。特别是DOL/Tween-20系统为环境友好的肽合成提供了替代方案，避免了DMF的使用。收敛合成策略（如NCL和DSL）使得合成极长且高度糖基化的肽段成为可能，为研究糖簇化对生物大分子结构和功能的影响打开了新的大门。

结论展望

本研究通过开发高效合成方法，首次实现了MUC5AC肽的极限糖簇化修饰，并深入揭示了糖基化程度与肽骨架刚性之间的定量关系。发现表明：1）非糖基化MUC5AC串联重复采取无规卷曲构象；2）渐进式α-O-GalNAc化稳定PPII螺旋构象，伴随末端距离增加；3）苏氨酸的GalNAc化能诱导PPII构象，而丝氨酸不能；4）CD检测到PPII构象并不足以表明刚性化；5）67%的潜在糖基化位点占据是实现刚性化的阈值；6）完全GalNAc化诱导每个氨基酸约2.5 ?的螺旋上升。未来研究将探索空间需求更大的寡糖是否能在较低糖基化程度下诱导刚性化。