外周血线粒体基因组变异与妊娠期糖尿病及产后糖代谢异常的遗传关联研究

本研究通过病例对照设计，首次系统揭示了线粒体DNA（mtDNA）D-loop区单核苷酸多态性（SNP）、单倍群及拷贝数与妊娠期糖尿病（GDM）及产后糖代谢异常（AGM）的显著关联，为GDM的病因学提供了新的线粒体遗传证据，对早期风险预测和干预策略具有重要临床意义。

　　

引言

妊娠期糖尿病（GDM）是指在妊娠期间发生的不同程度糖耐量异常，是最常见的妊娠期代谢性疾病，对母婴健康均产生重要负面影响。全球GDM患病率约为14%，其人群健康负担显著。GDM患者产后发生2型糖尿病（T2DM）的风险较正常孕妇增加近10倍，约20–50%的患者在分娩后5年内发展为T2DM。产后发生糖代谢异常的风险因素包括肥胖、亚洲人种、糖尿病家族史、高龄产妇、妊娠24周前确诊GDM、孕期高血糖及需要胰岛素治疗等。

线粒体DNA（mtDNA）D-loop区是其复制与转录的关键调控区域，也是线粒体基因组中变异最高的区域。该区域的突变可能导致线粒体功能障碍，进而影响神经退行性疾病和肿瘤等多种疾病的发生发展。mtDNA突变累积形成不同的单倍群（haplogroup），赋予个体对特定疾病的遗传易感性。近年研究表明，mtDNA单倍群可调节三磷酸腺苷（ATP）合成和活性氧（ROS）产生，并与阿尔茨海默病、帕金森病、Leber遗传性视神经病变等疾病相关。多项研究也提示mtDNA单倍群在2型糖尿病的发生与疾病管理中扮演重要角色。然而，目前关于mtDNA单倍群与GDM遗传易感性的研究仍较少，亟需大样本研究加以验证。

mtDNA拷贝数下降会导致线粒体转录下调及氧化磷酸化水平降低。一项大型女性人群随访研究表明，全血mtDNA低拷贝数可能是2型糖尿病风险的预测因子。另有证据显示，妊娠早期孕妇血清中血浆mtDNA水平升高，或可作为预测GDM的生物标志物。然而，关于早期血液mtDNA拷贝数是否与GDM发生风险相关，目前尚无一致结论，亦缺乏其对产后糖代谢异常影响的研究。

材料与方法

研究对象

本研究纳入2020年7月至2023年7月期间于我院建档的14–20周孕产妇共1000例，采集其外周血样本。对确诊GDM的孕妇，在产后4–12周再次采集外周血。GDM诊断采用国际糖尿病与妊娠研究组（IADPSG）标准，对孕前无糖尿病的孕妇行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。根据诊断标准共纳入500例GDM患者，另选500例糖耐量正常孕妇作为对照。对GDM孕妇在产后4–12周进行OGTT随访。产后糖代谢异常（AGM）包括空腹血糖受损（IFG；110 mg/dL ≤ FPG < 126 mg/dL）、糖耐量减低（IGT；140 mg/dL ≤ 2h血糖 < 200 mg/dL）或糖尿病（DM；FPG ≥ 126 mg/dL 和/或 2h血糖 ≥ 200 mg/dL）。收集基线与临床资料，包括年龄、体重指数（BMI）、孕产史、OGTT结果、血型、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆汁酸（TBA）、尿酸（UA）和尿素等指标。本研究经西南医科大学伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。

SNP检测与单倍群分类

提取全血基因组DNA后，采用聚合酶链反应（PCR）扩增mtDNA D-loop区序列，经琼脂糖凝胶电泳验证后行Sanger测序。D-loop扩增引物为：F-CGCCTACACAATTCTCCGATC，R-ACTTGGGTTAATCGTGTGACC；测序引物为：F1-TCATTGGACAAGTAGCATCC，F2-GTCCCTTGACCACCATCCTC。测序结果经DNAMAN和MitoTool软件分析，获取SNP信息并进行单倍群分类。

线粒体DNA拷贝数检测

提取全血及血浆DNA后，采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测mtDNA拷贝数。全血mtDNA拷贝数检测以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1（ND1）为目标基因，β-珠蛋白为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。血浆游离mtDNA拷贝数检测则通过合成含ND1基因序列的质粒，构建标准曲线，获取样本绝对浓度。ND1引物为：F-CCCCATGGCCAACCTCCTACTCCTC，R-AGCCCGTAGGGGCCTACAACG；β-珠蛋白引物为：F-ACACAACTGTGTTCACTAGC，R-CAACTTCATCCACGTTCAGC。

统计分析

采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 9软件进行统计分析。组间比较采用独立样本t检验或卡方检验、单因素方差分析；多因素Logistic回归分析用于相关风险因素评估；以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

研究对象基本特征

共纳入1000例孕妇，分为GDM组（n=500）和正常糖耐量（NGT）组（n=500）。GDM组孕妇年龄为31.43±4.01岁，NGT组为29.76±3.99岁（P<0.001）；GDM组孕妇BMI（P<0.001）、尿酸（P=0.001）、AST/ALT（P=0.037）及OGTT各时点血糖值（P<0.001）均显著高于NGT组，而孕次、产次、血型、总胆汁酸和尿素等指标两组间无显著差异。

完成产后4–12周随访的GDM患者共253例，失访247例。将其分为产后糖代谢异常组（AGM；n=40）和产后NGT组（n=213）。结果显示，产后AGM组OGTT各指标均显著高于产后NGT组（P<0.05），而年龄、BMI、孕产史、血型、AST/ALT、尿素、尿酸和胆汁酸等指标两组间无显著差异。

D-loop区多态性位点与GDM相关性分析

对所有研究对象mtDNA D-loop区进行Sanger测序，并与rCRS序列比对发现，GDM组与对照组在249d、309+C和16193+C三个SNP位点分布存在显著差异。249d（P=0.016，OR=1.428，95%CI=1.069–1.908）在GDM组中携带频率更高，是G发生的风险因素；而309+C（P=0.023，OR=0.742，95%CI=0.574–0.959）和16193+C（P=0.022，OR=0.540，95%CI=0.319–0.914）在GDM组中携带频率较低，表现出保护性作用。

在产后AGM与NGT组中，发现mtDNA D-loop区204T>C在产后AGM患者中携带频率显著更高（P=0.043，OR=2.553，95%CI=1.031–6.321）。

线粒体DNA单倍群与GDM相关性分析

基于线粒体系统发育树对Sanger测序结果进行单倍群分类，经年龄和BMI校正后的Logistic回归分析显示，单倍群M*（P=0.011，OR=0.895，95%CI=0.857–0.935）在GDM组中频率较低，是保护因素；而单倍群R9（P=0.044，OR=0.698，95%CI=0.493–0.990）在GDM组中频率较高，是风险因素。

在产后AGM与NGT组中，校正年龄和BMI后，单倍群M7b（P=0.016，OR=0.288，95%CI=0.105–0.794）和N9a（P=0.008，OR=0.077，95%CI=0.012–0.514）在产后AGM患者中频率更高。

线粒体DNA拷贝数分析

按年龄和BMI匹配200例患者与200例正常孕妇，发现GDM组全血mtDNA拷贝数略低于对照组（P=0.002）。进一步分为单胎与双胎组比较，发现在单胎妊娠中GDM组全血mtDNA拷贝数低于对照组（P=0.025），双胎组中也得到一致结果（P=0.003）。产后AGM组全血mtDNA拷贝数低于产后NGT组（P=0.031）。

比较GDM组与对照组的血浆mtDNA拷贝数，发现GDM组血浆游离mtDNA拷贝数平均为4.333×10⁴ copies/mL，高于对照组的3.297×10⁴ copies/mL（P=0.002）。产后AGM组血浆游离mtDNA拷贝数也高于产后NGT组，差异具有统计学意义（P=0.002）。

讨论

本研究通过病例对照设计，系统分析了mtDNA D-loop区SNP、单倍群及拷贝数与GDM及AGM的关联。结果显示，249d位点是GDM的独立风险因素，309+C和16193+C则具有保护作用；单倍群R9和M*分别作为GDM的风险和保护单倍群；M7b和N9a与产后AGM风险升高相关。此外，GDM组全血mtDNA拷贝数低于对照组，而血浆游离mtDNA拷贝数则呈相反趋势，在产后AGM人群中也呈现一致变化，提示mtDNA生物合成可能参与GDM及AGM的病理生理过程。

mtDNA D-loop区突变可能影响其复制与转录调控功能，进而干扰细胞能量代谢并导致疾病。一项荟萃分析显示，线粒体D-loop T16189C多态位点与2型糖尿病风险相关。Liu等报道D-loop区C456T变异与GDM风险增加相关，而G16390A变异则与风险降低相关。本研究则进一步揭示249d、309+C、16193+C以及204T>C在GDM与产后AGM中的潜在作用，为mtDNA遗传标记在GDM预测中的应用提供了新依据。

不同线粒体单倍群可通过影响ATP合成与ROS production，参与多种疾病的发生。本研究发现在中国汉族人群中，单倍群M*对GDM具有保护作用，而R9则增加患病风险；M7b和N9a与产后AGM风险显著相关，这一发现与既往关于2型糖尿病的研究部分一致，但也存在差异，可能与人群选择、种族背景及单倍群分类标准不同有关。

mtDNA拷贝数变化与能量代谢疾病密切相关。本研究显示GDM患者全血mtDNA拷贝数下降，可能与白细胞线粒体功能受损、能量代谢障碍有关；而血浆游离mtDNA拷贝数升高，则可能反映细胞损伤或线粒体应激释放增加。这一现象在产后AGM组中同样存在，提示mtDNA拷贝数动态平衡可能是糖代谢异常的一个重要特征。

研究局限性

本研究存在几点局限性：首先，样本来源于中国汉族单一地区，由于mtDNA单倍群分布具有明显的种族和地域特异性，如R9在东亚人群中频率较高，可能导致对特定单倍群效应的过高估计。其次，研究仅聚焦于mtDNA D-loop区，未涵盖编码区基因（如ATP合酶或呼吸链复合体相关基因），这些基因可能与GDM发生存在交互作用。第三，全血mtDNA拷贝数仅反映外周血白细胞水平，而胎盘、骨骼肌等组织的mtDNA功能异常可能在GDM发病中起关键作用。此外，mtDNA拷贝数检测缺乏金标准，qPCR方法受引物设计和模板质量影响，可能导致绝对值偏差。产后糖代谢随访仅关注血糖水平，未检测胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和β细胞功能等关键指标，可能遗漏部分糖代谢异常亚型。最后，研究采用横断面设计，难以明确mtDNA变异与GDM及AGM的因果关系，需借助纵向队列研究、线粒体移植或基因编辑等功能实验进一步验证。

结论

本研究通过病例对照设计，首次系统揭示外周血线粒体基因组变异与GDM及产后AGM之间存在显著关联：249d位点是GDM的独立风险因素，309+C和16193+C具有保护作用；单倍群R9和M*分别作为GDM的风险与保护因素，M7b和N9a与产后AGM风险升高相关。此外，GDM患者全血mtDNA拷贝数降低，而血浆游离mtDNA拷贝数升高，这一变化在产后AGM人群中也一致存在，表明mtDNA拷贝数平衡可能参与糖代谢异常的病理过程。然而，由于研究人群单一、仅检测D-loop区变异及横断面设计等限制，结论的普适性和因果性仍需多民族队列、纵向随访及功能实验的进一步验证。