基于分散液液微萃取与高分辨质谱联用技术的海水和贻贝中脂溶性海洋生物毒素的靶向与非靶向分析研究及其在马尔梅诺尔潟湖的应用

本研究针对有害藻华导致的脂溶性海洋生物毒素污染问题，开发了分散液液微萃取（DLLME）结合液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的分析方法，实现了海水和贻贝样品中8种脂溶性生物毒素（OA、DTX-1、DTX-2、DTX-3a、GAM、44-GAM、YTX、hYTX）的高灵敏度检测（海水LOD 0.0004-1.7 ng·mL-1，贻贝LOD 0.06-119 ng·g-1）。通过在西班牙马尔梅诺尔潟湖的实地采样研究，首次发现该区域存在OA（0.006-0.028 ng·mL-1）和DTX-3a（0.8-1.5 ng·mL-1）污染，并利用自建93种化合物数据库的非靶向筛查技术，在赤潮水样中鉴定出新型不饱和酯类衍生物（14:3 7-O-acyl OA/DTX-2）。该研究为复杂水体环境中痕量生物毒素的监测提供了创新方法学支撑。

　　

在全球气候变化和人类活动加剧的背景下，有害藻华（Harmful Algal Blooms, HABs）现象日益频发，其所产生的海洋生物毒素通过食物链积累，严重威胁海洋生态系统安全和公众健康。其中，脂溶性海洋生物毒素因其高毒性和生物累积性备受关注，特别是冈田酸（Okadaic Acid, OA）及其衍生物、虾夷扇贝毒素（Yessotoxins, YTXs）和冈比尔毒素（Gambierones, GAMs）等。然而，传统检测方法在面对复杂环境样品中痕量毒素的精准识别与定量时，仍面临灵敏度不足、覆盖化合物范围有限等挑战。西班牙马尔梅诺尔潟湖作为地中海地区典型的半封闭滨海湿地生态系统，近年来因富营养化问题多次发生赤潮事件，但该区域脂溶性生物毒素的污染状况至今未有系统研究。

为应对这一挑战，由Murcia大学Lixy Olinda León-Morán领衔的研究团队在《Marine Pollution Bulletin》发表了创新性研究成果。该研究成功开发了分散液液微萃取（Dispersive Liquid-Liquid Microextraction, DLLME）与液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（LC-QTOF-HRMS）联用的分析方法，实现了海水和贻贝样品中8种关键脂溶性生物毒素的同步检测，并首次建立了包含93种衍生物的自建数据库用于非靶向筛查。研究团队于2021年9月赤潮期间和2023年3月非赤潮期，在马尔梅诺尔潟湖四个典型区域采集了23份海水样品，同时分析了4份市售贻贝样品。通过优化色谱条件（采用ZORBAX RRHD Eclipse Plus C₁₈色谱柱，pH=8.5的5 mM醋酸铵-甲醇流动相体系）和微萃取参数（氯仿为萃取剂，甲醇为分散剂），显著提升了方法的灵敏度与选择性。

在方法学验证方面，研究显示了优异的分析性能：海水基质中检测限（LOD）达0.0004-1.7 ng·mL^-1，贻贝基质中为0.06-119 ng·g^-1；日内精密度RSD<10.1%，加标回收率85.5-121%。通过标准参考物质（CRM-DSP和CRM-FDMT1）验证，该方法对OA、DTX-1、DTX-2和YTX的测定结果与认证值无显著差异（p>0.05），证实了方法的准确度。

3.1. 环境条件与采样点特征

研究区域在水华期间呈现典型富营养化特征：水温27.13°C，叶绿素a浓度6.29 μg·L^-1，铵盐（1.45 μmol·L^-1）和磷酸盐（0.90 μmol·L^-1）浓度升高，溶解氧饱和度93.73%。这些条件为赤潮发生提供了适宜环境，但有趣的是，毒素浓度并未与藻华强度呈正相关。

3.2. 色谱条件与样品前处理优化

碱性流动相（pH=8.5）显著提升了电喷雾负离子化模式下大多数毒素的响应信号。与乙腈相比，甲醇作为有机相使信号强度提升2-5倍。DLLME优化表明450 μL氯仿为最佳萃取剂体积，贻贝样品采用5 g样本与5 mL甲醇的固液萃取前处理。

3.3. 方法学验证

线性范围覆盖0.001-500 ng·mL^-1（海水）和0.2-1500 ng·g^-1（贻贝）。YTX类毒素因严重基质效应未纳入贻贝验证。CRMs分析中首次定量出DTX-3a（9.8 ng·g^-1）和未认证的14:3 7-O-acyl OA/DTX-2酯类衍生物（36-46 ng·g^-1）。

3.4. 非靶向筛查在CRMs中的应用

通过自建数据库的疑似筛查，在CRMs中发现m/z 1007.6082（误差-1.9 ppm）的离子信号，推测为14:3 7-O-acyl OA/DTX-2酯类衍生物（置信度等级5）。这证明了非靶向方法在发现新型毒素衍生物方面的优势。

3.5. 实际样品分析结果

赤潮期水样中未检出目标毒素，但非赤潮期50%样品检出OA（0.006-0.028 ng·mL^-1），22%样品检出DTX-3a（0.8-1.5 ng·mL^-1）。Rambla del Beal区域浓度最高，可能与陆源营养盐输入有关。贻贝样品中西班牙B批次检出OA（7.99 ng·g^-1）和DTX-2（1.19 ng·g^-1），但均低于欧盟限值（160 μg OA当量·kg^-1）。非靶向分析在赤潮水样中发现17.6 ng·mL^-1的未饱和酯类衍生物，其色谱峰（R_t 17.267 min）与CRMs中发现的化合物一致。

4. 讨论与结论

本研究首次将DLLME与LC-HRMS非靶向筛查技术结合用于脂溶性海洋生物毒素监测，方法灵敏度优于多数文献报道的SPE、LLE等传统方法（见表6对比）。研究发现马尔梅诺尔潟湖虽经历严重富营养化，但脂溶性毒素污染水平显著低于挪威海岸（0.004 ng·mL^-1）和西班牙地中海沿岸（1.78 ng·mL^-1）等区域，揭示该生态系统可能通过顶级捕食者的调控作用（top-down control）抑制毒素生物累积。值得注意的是，赤潮期间并未出现毒素浓度升高，表明温度、营养盐等环境因子与毒素产生之间存在复杂非线性关系。

该研究的创新性在于：①首次建立DLLME-LC-HRMS方法用于脂溶性毒素的非靶向筛查；②首次揭示马尔梅诺尔潟湖的OA、DTX-3a及其酯类衍生物污染现状；③构建包含93种化合物的本地数据库为后续研究提供资源。研究成果为滨海湿地生态系统的毒素风险评估提供了新方法学工具，对完善赤潮预警体系和海产品安全监管具有重要意义。未来研究需重点关注氮磷化学计量比（N:P ratio）对毒素生成的调控机制，以及酯类衍生物的生物活性与健康风险。