综述：冷冻电镜与溶液核磁共振波谱学协同揭示蛋白酶机器的变构调控

本综述系统阐述了冷冻电镜（cryo-EM）与甲基-TROSY核磁共振（NMR）光谱技术在研究大型蛋白酶复合物变构调控机制中的协同优势。通过p97、ClpP及DegP等典型案例，揭示了这些多亚基机器通过精巧的构象动力学（如NTD的“上/下”转换、handle螺旋变构开关及PDZ介导的笼式组装）实现功能调控的分子基础，为针对癌症、神经退行性疾病及耐药菌感染的新型治疗策略提供了结构生物学见解。

　　

蛋白酶稳态与蛋白酶机器

细胞内蛋白质降解是维持所有生物体稳态的核心机制，其功能依赖于精细的三维结构和调节结构的构象动力学。由于这些系统具有大分子量、固有的构象可塑性和寡聚异质性，其作用机制无法通过单一方法解析。冷冻电镜（cryo-EM）能够对参与蛋白质降解的大型构象异质复合物进行结构表征，而甲基-TROSY核磁共振（NMR）则可在原子分辨率下监测这些系统在溶液中响应各种刺激的结构转变和构象动力学。这两种技术的协同应用为揭示复杂多组分生物分子机器中的变构通路提供了独特而强大的手段。

捕捉结构异质性与动力学：cryo-EM与NMR的结合

cryo-EM通过提供多种共存构象状态的快照，在揭示蛋白酶的结构运动方面表现出强大能力。尽管普遍存在的结构异质性仍然是一个挑战，但cryo-EM图像处理的计算进展使得识别和分类共存状态成为可能，并促进了基态以外构象的重建。溶液NMR光谱通过其以原子化和定量细节同时告知能量景观参数和其中生物分子结构的能力，非常适合应对这一挑战。NMR对跨越广泛时间尺度（皮秒到秒）的生物分子动力学敏感，这些时间尺度与不同类型的结构波动相关。甲基-TROSY的发展极大地扩展了可通过溶液NMR光谱研究的分子尺寸上限，使得对兆道尔顿尺寸复合物的研究成为可能。

结合方法研究动态蛋白酶稳态机器

p97

p97（也称为VCP或酵母中的Cdc48）是一种保守的真核生物AAA+酶，参与多种与蛋白酶稳态相关的细胞功能。其功能状态是同源六聚体，每个亚基包含一个N端结构域（NTD）、两个串联核苷酸结合结构域和一个短的C端结构域。NTD可以采用“上”或“下”构象，分别位于D1环上方或与D1环共面。核苷酸结合和水解产生的变构信号导致NTD的大规模结构域运动。通过甲基-TROSY NMR研究p97颗粒的NTD动力学，揭示了疾病相关突变如何影响p97功能。这些突变破坏了NTD天然的“上”/“下”平衡，其失调程度与疾病严重程度相关。冷冻电镜结构为这些改变的动力学提供了结构基础，表明NTD和D1结构域之间关键接触的破坏改变了NTD动力学，进而影响p97功能。对包含单个NMR可见突变亚基和NMR不可见背景的异质p97复合物的NMR研究显示，NTD失调是组成依赖性的，突出了亚基间的协同性。

ClpP

案例水解蛋白酶P（ClpP）是一种存在于细菌、质体和人类线粒体中的保守丝氨酸蛋白酶。它通过调节靶蛋白底物的降解，作为蛋白酶稳态网络的关键组成部分。ClpP的结构在所有生命领域中都保留，通过堆叠两个同源七聚体环形成桶状复合物，14个催化位点隐藏在内部。每个亚基的头部结构域组装成七聚体环，而柄部结构域介导环间相互作用形成成熟的十四聚体ClpP复合物。比较不同生物体的结构发现了ClpP桶的三种状态：紧凑、压缩或延伸。这些状态在桶高度和柄螺旋的构象上有所不同。在紧凑或压缩形式中，该组装是无活性的，柄螺旋部分无序或扭结，导致催化三联体错位。相比之下，在活性形式中，它完全伸展，催化残基因此最佳定向用于催化。结合NMR和cryo-EM研究提供了对柄结构域动力学与ClpP活性相关的更全面理解。这些研究表明柄螺旋在溶液中占据不同的构象，这些群体受到pH、小分子结合和NTD内结构波动等因素的影响。柄螺旋的动力学也可以通过靶向腔室轴向末端来调节，距离约50?远。小分子激活剂与RP结合位点的结合通过ClpP复合物的变构激活显示出杀菌作用，从而促进细胞内不受调节的底物降解。NTD内的点突变也可以影响柄螺旋内的动力学。这些正交观点清楚地表明，亚基间和亚基内的协同性调节ClpP功能，柄螺旋作为活性的开/关开关。

DegP

周质蛋白降解蛋白酶（DegP）是一种存在于大肠杆菌和其他革兰氏阴性病原体周质中的丝氨酸蛋白酶，有助于维持细菌蛋白酶稳态。它属于HtrA蛋白家族，既作为ATP非依赖性蛋白酶，又作为分子伴侣。DegP结构在所有生命领域中保留，每个亚基包含一个N端丝氨酸蛋白酶结构域和至少一个C端PDZ结构域。它们以三聚体为基本寡聚单位，通过组成单体的蛋白酶结构域之间的相互作用稳定。DegP单体包含两个C端PDZ结构域，称为PDZ1和PDZ2。在这里，PDZ1与DegP底物结合，而PDZ2介导与其他三聚体的相互作用，而不是参与底物相互作用。DegP单体内部结构域之间的灵活连接区赋予了显著的可塑性，便于采用各种高级寡聚组装。晶体学研究提供了这些DegP组装的一些首批高分辨率细节。在apo状态下，DegP以六聚体形式存在，通过两个三聚体以“面对面”方式堆叠形成，其中活性位点位于复合物的核心。发现六聚体采用“关闭”或“开放”构象，由复合物内腔的可及性定义。后来的结构研究，包括晶体学和基于cryo-EM的方法，揭示了底物结合触发了三聚体间接触的重组和新颖的、基于三聚体的寡聚状态的采用。这些研究发现了由12或24个单体组成的高阶笼状组装，通过PDZ1和PDZ2结构域之间的相互作用稳定。此外，这些笼状物种被显示为封装结合的底物进行蛋白水解。随后的DegP研究使用溶液NMR结合流体动力学方法，揭示了在缺乏底物的情况下，DegP通过三聚体介导采用一系列相互转换的寡聚体。有趣的是，通过浓度和温度依赖的动态光散射测量显示，三聚体组装通过两条竞争途径A或B发生。cryo-EM的其他近期研究也发现了新的寡聚状态。揭示了除了在肽或无序蛋白存在下确定的经典12和24聚体外，还可以形成许多不同的笼状组装。发现底物N末端部分的大小与形成的DegP笼的规模之间存在相关性。结合高分辨率cryo-EM和溶液NMR研究应用于DegP或许是这两种方法协同作用的最显著例子之一。

结论

蛋白酶稳态在所有生命领域都至关重要，维持它的生物分子机器通常形成大型寡聚复合物，并表现出协同行为。事实上，据估计大约70%的人类蛋白质采用寡聚组装，其中变构无处不在。对这些生物分子机器中亚基间和亚基内变构通讯的更深入理解可能为这些复合物发生突变的疾病提供有希望的功能调节策略。关于蛋白质降解机器作用机制的许多悬而未决的问题通常源于这些系统高度动态和异质的事实，这使得它们在结构上难以表征。底物标记、识别和蛋白水解所涉及的机制可能无法使用任何单一方法阐明。本综述强调了整合能够探测结构异质性和可塑性的不同结构生物学工具的必要性。