综述：邻近标记技术在捕获生物分子相互作用中的进展

这篇综述系统梳理了2023至2025年间邻近标记（PL）技术的突破性进展，重点介绍了催化系统创新（如新型酶开发、级联反应和环境响应系统）、内源性靶标标记策略以及标记半径测定技术（如超分辨成像和DNA纳米结构应用），为解析蛋白质相互作用网络（PPIs）、亚细胞蛋白质组学和细胞间通讯提供了关键方法学支持。

　　

引言

邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术已成为解析活体系统中生物分子相互作用的关键手段，能够捕获蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）、RNA-蛋白质相互作用、药物-靶点相互作用以及细胞-细胞相互作用等动态过程。该技术通过利用混杂酶或化学催化剂在目标蛋白（POI）附近产生活性中间体，实现对邻近分子的共价标记，再通过亲和纯化与质谱或RNA测序分析揭示相互作用网络。

催化系统创新

近年来，PL技术最显著的进展集中在催化系统的创新上，包括新型酶开发、级联反应设计以及环境响应系统的构建。

新型酶工具

2023年，Tanner团队通过定向进化开发了G-四链体过氧化物酶模拟DNAzyme——mSBDZ-X-3，其合成简便、稳定性高且抗水解能力强，但仍需过氧化氢（H₂O₂）激活。为规避H₂O₂依赖性问题，光依赖与光独立酶系统被陆续开发。Muir团队整合光-氧-电压（LOV）结构域构建了光诱导互作标记系统（LITag），可在蓝光照射1–3秒内实现标记，但对核仁蛋白标记效率有限。Ting团队将光敏感LOV结构域与TurboID融合，开发出LOV-TurboID，通过低强度蓝光激活显著降低背景标记，但在分泌 compartments 和线粒体基质中活性较低。

光独立酶方面，Hamachi团队于2024年发现细菌酪氨酸酶（BmTyr），无需H₂O₂即可在10分钟内完成低背景蛋白标记，在小鼠大脑区域特异性蛋白质组研究中展现出优异生物相容性。Ting团队通过定向进化真菌漆酶获得LaccID，利用分子氧催化芳香底物单电子氧化，避免了H₂O₂的使用，但目前仅适用于细胞表面蛋白质组映射，且需1–2小时标记时间。

级联反应系统

为提升空间选择性，级联反应PL系统被开发。Pan团队发现，在超氧化物歧化酶和蓝光照射下，单线态氧光敏蛋白-3可将氧气转化为H₂O₂，进而激活APEX2介导的PL，无需外源H₂O₂，标记时间短于10秒，适用于细胞器接触位点和细胞界面研究。Ju团队开发了两级空间定位邻近标记（P²L）系统，通过半乳糖氧化酶（GAO）氧化半乳糖生成H₂O₂，再激活HRP实现标记，可区分异质细胞群体中的糖基化水平差异。

环境响应系统

内源信号激活的PL系统具有独特优势。Weerapana团队利用内源性活性氧（ROS）作为H₂O₂来源激活APEX，监测ROS热点区域的氧化事件。Ju团队通过将HRP锚定于应激源（如真菌模拟物），利用宿主细胞（如巨噬细胞）释放的H₂O₂触发PL，动态记录细胞-细胞相互作用相关的应激水平。Ingolia团队开发了钙离子感应生物素连接酶Cal-ID，通过钙调蛋白感知局部Ca²⁺波动，实现Ca²⁺信号和神经元活动的空间分辨记录。

内源性靶标标记策略

传统PL依赖基因工程表达融合蛋白，可能干扰天然POI的结构与功能，且在难转染细胞或动物模型中应用受限。近年来，配体导向和抗体/凝集素导向PL策略为内源性靶标研究提供了新方案。

配体导向PL

该类方法通过将PL酶或光催化剂与配体（适配体、小分子、肽或蛋白质）偶联，结合天然POI后触发标记。Ding团队将细胞特异性适配体与HRP偶联，实现靶细胞选择性标记。Tanner团队利用DNA适配体靶向癌细胞表面标志物，结合DNAzyme标记膜抗原邻近蛋白。MacMillan团队将小分子配体与铱（Ir）光催化剂连接，通过μMap平台鉴定蛋白靶点与配体结合位点。Hamachi团队将小分子配体与BmTyr偶联，在小鼠大脑中映射内源性神经递质受体的邻近蛋白质组。Ting团队将GLP-1激动肽与APEX2偶联，揭示激活态GLP-1受体在细胞膜上的互作网络。Saeed团队将Ir光催化剂与SARS-CoV-2刺突蛋白偶联，解析病毒蛋白与宿主细胞表面蛋白的互作组。

抗体/凝集素导向PL

该方法利用靶标特异性抗体或凝集素实现内源性互作组标记。MacMillan团队通过μMap平台将Ir光催化剂与抗体偶联，标记PD-L1周围蛋白质组。Wells团队通过位点特异性引入Ir到一抗中，实现距离校准PL，并开发MultiMap平台，通过偶联伊红Y（Eosin Y）抗体激活多探针，解析免疫突触蛋白质组。Seath和Fan团队利用抗体光PL策略映射原代肿瘤组织中的EGFR互作组和肿瘤-免疫界面。Zou团队利用HRP偶联抗体靶向轴突起始段（AIS）蛋白NFASC，揭示神经元发育中AIS蛋白质组的动态变化。MacMillan团队使用IgG-opsonized beads偶联Ir光催化剂标记吞噬界面，捕获吞噬过程中的细胞表面蛋白质组快照。Huang和Mao团队利用凝集素（半乳糖凝集素-3或Siglec-9）与APEX2偶联，标记可能与特定糖链相关的蛋白质。

细胞器靶向应用

化学光催化剂的应用扩展了细胞内原生 compartments 的标记能力。线粒体、内质网、溶酶体等细胞器均可通过特异性催化剂实现原位标记。Fan团队开发的溶酶体特异性催化剂LysoCat，克服了酸性环境和低蛋白丰度挑战，实现了活细胞中溶酶体蛋白质组动态解析。

标记半径的精确测定

标记半径的精确测定对PL工具的选择与优化至关重要。早期研究通过核孔复合体或电子显微镜估算BioID和APEX的标记半径分别为10 nm和20 nm，但缺乏精准测量。

超分辨成像与DNA纳米结构应用

MacMillan团队利用受激发射损耗显微镜（STED）测量PL反应标记半径，发现过氧化物酶酚氧自由基系统标记半径为269±41 nm，而Ir催化剂μMap平台仅为54±12 nm。长寿命中间体（如氮宾）标记半径（119±33 nm）大于卡宾，慢扩散底物（如PEG24-PhN₃）标记半径（80±28 nm）小于快扩散底物（PEG3-PhN₃）。Shi团队建立邻近标记扩展显微镜（PL-ExM），发现HRP催化标记空间精度高于APEX2，线粒体标记直径分别为0.56 μm和0.97 μm。Chen团队利用DNA纳米结构平台测定TurboID和APEX2的标记半径，发现TurboID以接触依赖方式为主（≤6 nm），而APEX2通过直接接触（约10 nm）和扩散机制（最大500 nm）共同介导标记。

标记半径调控策略

通过底物化学修饰可调控中间体半衰期，从而精细调节标记半径。Tian团队发现APEX2中使用BN2探针比BP具有更小标记半径，更适合捕获胞质蛋白复合物。Chen团队利用半衰期为秒级的醌甲基底物实现微米级标记半径，用于细胞组织结构分析。Wells团队比较了重氮丙啶（高分辨率）、芳基叠氮（中）和酚（低）底物的标记精度，通过多尺度PL蛋白质组学平台系统重建细胞表面互作组。

展望

尽管PL技术在活细胞中取得了显著进展，但其在活体应用中仍面临标记效率、标记残基特异性与多样性、背景噪声以及低丰度靶标检测灵敏度等挑战。未来需进一步优化工具设计，建立标准化模型与平台，以推动其在生理与病理过程中的广泛应用。