mcr-3基因的适应性代价：全球流行趋势、分子机制与新型抑制剂研究

《eBioMedicine》：Fitness costs of mobilised colistin resistance gene 3 ( mcr-3): systematic review, epidemiological study, and functional analysis

本文针对粘菌素耐药基因mcr-3在全球持续传播的问题，系统研究了其流行特征、适应性代价机制及抑制策略。研究人员通过系统回顾、流行病学调查和功能实验，发现mcr-3在中国禁用药用粘菌素后仍持续扩散，其低适应性代价与5'端密码子偏好性介导的mRNA稳定性降低有关，并筛选出靶向脂质A结合口袋的MCR抑制剂，为控制mcr-3传播提供了新策略。该研究对应对多重耐药革兰阴性菌感染具有重要意义。

　　

随着多重耐药革兰阴性菌感染的日益严重，粘菌素作为"最后一道防线"抗生素的地位愈发关键。然而，移动性粘菌素耐药基因（mobilized colistin resistance, mcr）的出现和传播严重威胁了粘菌素的临床疗效。其中，mcr-1和mcr-3是mcr家族中两个最主要的成员。有趣的是，自2017年中国禁止在动物饲料中使用粘菌素后，mcr-1的流行率显著下降，但mcr-3的传播趋势却截然不同，其流行率不降反升。这一现象引发了研究人员的关注：为什么mcr-3能够在缺乏抗生素选择压力的情况下持续传播？其背后的分子机制是什么？能否找到有效策略来控制mcr-3的传播？

为了回答这些问题，中山大学医学院免疫学系的研究团队在《eBioMedicine》上发表了一项综合性研究。研究人员通过系统回顾和meta分析研究了2005-2022年间mcr-3的全球流行趋势，并在中国8个省份开展了前瞻性流行病学研究。同时，他们通过体外和体内竞争实验、形态学研究和荧光观察等方法评估了MCR-3对细菌宿主的适应性代价，并利用密码子优化和分子动力学模拟等技术深入探究了其分子机制。最后，通过虚拟筛选从小分子库中鉴定出了靶向MCR蛋白的抑制剂。

研究结果显示，mcr-3的全球流行率从2005-2014年的0.18%迅速上升至2020-2022年的3.41%。在中国，mcr-3的流行率从2016年的0.79%持续增加到2019年的5.87%，表明粘菌素在畜牧业中的禁用并未阻止mcr-3的传播。

mcr-3阳性大肠杆菌在体外和体内均表现出比mcr-1阳性菌株更强的适应性

研究人员通过体外竞争实验发现，携带mcr-3的大肠杆菌与空质粒对照的适应性相当，但显著高于mcr-1阳性菌株。在小鼠肠道定植模型中，mcr-3阳性细胞也显示出比mcr-1阳性细胞更强的适应能力，其在灌胃后48小时的竞争指数达到57.3，而mcr-1阳性菌株仅为10.7。

MCR-3阳性大肠杆菌表现出完整的膜完整性

扫描电镜结果显示，mcr-1阳性细胞表面出现皱纹和断裂，而mcr-3阳性细胞和对照细胞的膜完整且光滑。NPN摄取实验和PI染色实验进一步证实，MCR-3的表达对细菌内膜和外膜的完整性没有显著影响。转录组学分析发现，mcr-1阳性细胞中胶囊合成相关基因（wca家族）转录水平上调，而谷氨酸-GABA依赖的酸应激反应通路基因（gad家族）的转录被抑制，这可能解释了mcr-1阳性菌在酸性环境（如人体消化道）中适应能力较差的原因。

5'端低使用频率密码子保证了mcr-3阳性大肠杆菌的低适应性代价

分子动力学模拟显示，MCR-3与MCR-1的脂质A结合口袋高度相似，但mcr-3在5'编码区存在显著的密码子偏好性。研究人员发现，mcr-3的5'端聚集了大量使用频率低的密码子，这降低了mRNA的稳定性，进而减少了其在大肠杆菌中的蛋白表达，最终导致细菌宿主的低适应性负担。将mcr-3前30bp片段进行密码子优化（5'-opi）后，其mRNA和蛋白表达水平分别提高了4.6倍和6.3倍，但细菌的生长速率和适应性显著降低，膜通透性增加。

mRNA 5'端密码子使用偏好性与mcr家族的进化密切相关

对mcr家族成员（mcr-1到mcr-8）的分析显示，mcr-3、mcr-4、mcr-5和mcr-8的5'端比mcr-1和mcr-2富集了更多使用频率低的密码子。mcr基因的5'端CAI值与其在大肠杆菌中的mRNA水平（ρ = 0.962）和蛋白表达水平（ρ = 0.985）高度相关。系统发育树和聚类分析结果表明，具有相似5'端CAI值的mcr基因呈现出相似的进化轨迹，表明5'端密码子最优性可能影响mcr家族的进化。

靶向推定脂质A结合口袋的抑制剂对mcr阳性大肠杆菌表现出显著效果

通过虚拟筛选，研究人员从小分子库中鉴定出了三种能同时靶向MCR-1和MCR-3脂质A结合口袋的抑制剂（化合物#1、#2和#3）。这些抑制剂能有效恢复mcr-1或mcr-3阳性大肠杆菌对粘菌素的敏感性，使粘菌素的MIC从16μg/mL降至4μg/mL。时间杀灭实验表明，化合物#3与粘菌素联用对mcr-1和mcr-3阳性菌株具有最强的协同杀菌效果。重要的是，这些抑制剂对mcr阴性但耐粘菌素的大肠杆菌菌株无效，表明其特异性靶向MCR蛋白。

该研究得出结论，mcr-3的流行率在2016-2019年间在中国持续上升，表明畜牧业中禁用粘菌素未能阻止mcr-3的传播。mcr-3通过5'端密码子偏好性降低mRNA稳定性，保证低蛋白表达水平，从而产生低适应性代价，这是其持续传播的重要原因。此外，推定的脂质A结合口袋是设计抗mcr阳性菌株抑制剂的有希望靶点。

这项研究的发现具有重要意义：首先，它揭示了mcr-3持续传播的分子机制，为理解抗生素耐药基因的进化提供了新视角；其次，研究表明5'端密码子偏好性是水平转移基因适应性代价的关键调控因子，这一发现可能适用于其他抗生素耐药基因的研究；最后，鉴定出的MCR抑制剂为临床治疗mcr阳性菌感染提供了新的治疗策略，特别是针对目前缺乏有效抑制剂的mcr-3阳性菌株。

研究的局限性包括：mcr-3的mRNA稳定性不仅受5'编码区密码子最优性调控；尽管mcr-3在mcr家族中介导的生物学负担最低，但其他mcr成员的实际流行率尚未确定；MCR-1和MCR-3之间不同的脂质A亲和力是否调节菌株特异性适应性差异仍不清楚；5'端密码子最优性、RraA依赖性mRNA降解和膜完整性之间的机制联系尚不明确；天然mcr-3启动子对MCR-3蛋白表达和宿主适应性的影响尚未系统表征；已鉴定的MCR抑制剂效力中等，需要结构优化以提高类药性。

总之，这项研究强调了需要更加关注mcr-3的潜在暴发风险，即使是在动物饲养中禁用粘菌素之后。鉴定的MCR特异性抑制剂可能代表一种有效恢复粘菌素对抗mcr阳性细菌疗效的替代策略。