冻干血小板来源的细胞外囊泡类似物的生成与功能表征：解决标准化难题及在药物递送中的应用前景

本研究针对血小板来源细胞外囊泡（P-EV）研究中存在的分离纯化标准不统一、荧光标记效率低以及新鲜血小板使用限制等问题，通过对比新鲜与冻干血小板经超声处理后产生的P-EV类似物（FP-EV与LP-EV），系统评估了其理化特性、表面蛋白表达及四种荧光染料（CFSE、DiO-C6、BCECF、CMFDA）的标记效果。研究发现LP-EV与FP-EV在粒径、蛋白组成和功能特性上高度相似，且CFSE和DiO-C6标记效果最优。进一步实验证明标记后的P-EV可被内皮细胞有效内化并定向至溶酶体，为利用冻干血小板规模化制备功能化P-EV提供了重要技术支撑，对推动P-EV作为药物载体和疾病标志物的临床应用具有显著意义。

　　

在生命科学与医学研究领域，血小板来源的细胞外囊泡（Platelet-derived extracellular vesicles, P-EV）正受到越来越广泛的关注。这些由血小板活化或储存过程中释放的磷脂双分子层囊泡，不仅携带丰富的蛋白质、脂质介质和microRNA等生物活性分子，参与细胞间通讯、免疫调节、血管修复等重要生理病理过程，更因其具备与母细胞相似的表面黏附受体和良好的生物相容性，而被视为极具潜力的靶向药物递送载体和疾病诊断标志物。然而，P-EV的研究与应用仍面临诸多挑战：其分离、纯化和荧光标记缺乏统一标准，且通常需依赖新鲜采集的血小板，这在实际操作中不仅成本高昂、物流复杂，更限制了其在临床中的可及性与重复性。

为此，来自荷兰马斯特里赫特大学的研究团队在《Extracellular Vesicle》发表了一项创新研究，系统探讨了以冻干血小板（lyophilized platelets）为原料制备P-EV类似物的可行性，并综合评价了多种荧光标记策略对其性质及细胞摄取行为的影响。该研究不仅为P-EV的高效、标准化制备提供新思路，也为其后续功能研究和临床应用奠定基础。

在研究过程中，作者主要采用了以下几项关键技术：首先，通过超声破碎法从新鲜或冻干血小板中制备P-EV类似物；其次，利用尺寸排阻色谱（SEC）进行纯化；再借助纳米颗粒追踪分析（NTA）、冷冻透射电镜（cryo-TEM）、流式细胞术和Western blot等技术对囊泡的粒径、形态、表面标志物（如CD41a、CD62P）及蛋白表达（如CXCL4、TSG-101、CD63）进行全面表征；最后，通过多种荧光染料标记并与人内皮细胞系EA.Hy926共培养，结合共聚焦显微镜观察和溶酶体共定位分析，系统评估了P-EV的细胞内化和命运。

研究结果主要包括以下几个方面：

3.1. 新鲜与冻干血小板来源P-EV类似物的基本表征

通过SEC分离、NTA和电镜分析发现，LP-EV与FP-EV在颗粒浓度、粒径分布（约110 nm）和磷脂双分子层结构方面高度相似，尽管LP-EV的蛋白含量略低，但两者在物理特性上无显著差异。此外，研究还比较了超声破碎与Ca²⁺离子载体诱导两种制备方式，发现超声法产量更高，且冻干血小板仍保留一定的刺激响应性。

3.2. P-EV类似物的分子组成

流式与Western blot结果表明，LP-EV与FP-EV均高表达血小板典型表面标志物CD41a（整合素α_IIb）、CD62P（P-选择素）及胞内蛋白CXCL4（血小板因子4），同时泛EV标志物TSG-101与CD63也呈阳性，证明冻干处理未明显改变其分子特征。

3.3. 荧光标记对P-EV的影响

在比较DiO-C6、CFSE、BCECF、CMFDA四种染料时，DiO-C6和CFSE表现出较高的标记效率和荧光强度，但所有染料均导致囊泡粒径增大，其中BCECF和CMFDA处理组粒径增加最为显著（近三倍）。CFSE在综合评估中表现最优，其在标记后粒径变化较小且信噪比高。

3.4. 细胞内吞实验

将CFSE或DiO-C6标记的P-EV与EA.Hy926细胞共培养，显示两者均可被有效内化，且摄取过程具有时间与温度依赖性（37°C > 4°C），但整合素α_IIbβ₃阻断剂eptifibatide并未显著抑制该过程，提示存在其他内化机制。

3.5. P-EV的胞内命运

通过cresyl violet染色溶酶体，并分析其与CFSE标记LP-EV的共定位情况，发现初期（1–4 h）P-EV分布于细胞质，而24 h后显著富集于溶酶体区域，显示其最终被导向降解途径。此外，溶酶体共定位程度随P-EV剂量增加而升高，在1000 EV/细胞条件下共定位率可达约70%。

在讨论部分，作者强调该研究首次系统证实冻干血小板可作为稳定、可靠的P-EV来源，其制备的LP-EV在物理特性、分子组成与功能行为（如细胞摄取与胞内运输）方面与FP-EV高度一致。CFSE因其标记稳定性佳、对囊泡性质影响小，被推荐为研究P-EV生物分布与细胞互作的首选荧光标记策略。此外，该研究建立的标准化的超声-SEC制备流程和多种表征手段也为P-EV研究的可重复性与跨平台比较提供重要基础。

总之，该研究不仅成功破解了P-EV来源受限、标记方法不统一等技术瓶颈，也为未来开展基于冻干血小板的囊泡载药系统、靶向治疗及疾病机制研究提供了坚实依据，具有显著的转化潜力和临床应用前景。