代谢抑制剂剖析揭示Lachancea thermotolerans表型与转录组对葡萄酒发酵化学的调控机制及其应用潜力

本研究针对葡萄酒发酵中酸度调控和风味优化的需求，研究人员通过应用靶向代谢抑制剂（如OXA、MET、DSF）对145株Lachancea thermotolerans进行表型与转录组学分析，发现oxamate（OXA）可显著降低乳酸和总酸（分别减少21%和26%），同时提高琥珀酸和pH，且不影响乙醇水平；metformin（MET）则大幅提升甘油（+25%）和乙酸（+319%）产量。该研究揭示了酵母代谢重编程的分子机制，为精准选育高性能酿酒酵母、优化葡萄酒酸度平衡和风味品质提供了新策略和理论依据。

　　

在葡萄酒酿造的世界里，酸度平衡是决定酒体结构与风味品质的核心要素之一。传统上，酿酒师依赖化学添加剂或混合发酵来调整酸度，但这些方法往往缺乏精准性，且可能影响酒质的自然与协调。尤其在全球气候变暖的背景下，葡萄成熟度提高导致酸度不足的问题日益突出，如何高效、自然地提升葡萄酒的酸度与新鲜感，成为酿酒工业面临的一大挑战。

非酿酒酵母(non-Saccharomyces yeasts)中的Lachancea thermotolerans（原名Kluyveromyces thermotolerans）因其独特的代谢特性受到关注。该酵母拥有乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性，可在发酵过程中直接产生乳酸，从而降低pH、增加酸度，这一过程不同于依赖苹果酸-乳酸发酵的细菌。此外，L. thermotolerans还能提升甘油、多糖等有益代谢物，降低高级醇和乙醇含量，有助于改善葡萄酒的口感和复杂性。然而，该酵母的应用仍存在明显局限：乙醇耐受性低（通常低于10%）、对二氧化硫敏感、低温下发酵缓慢，且不同菌株的产酸能力差异显著，这限制了其在工业中的广泛推广。

尽管已有研究通过菌株选育初步解决了部分问题，但L. thermotolerans代谢调控的分子机制及其表型多样性的根源尚未系统阐明。理解其代谢网络的关键节点和调控规律，对于定向选育高性能菌株、精准调控葡萄酒化学成分具有重要意义。代谢抑制剂的应用是解析微生物代谢多样性的一种有效策略，通过特异性抑制关键酶，可揭示代谢通量的分布变化，识别具有优良性状的菌株。

为此，研究人员在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上发表了一项整合表型组与转录组的研究，系统分析了145株L. thermotolerans对多种代谢抑制剂的响应，揭示了其代谢灵活性及调控机制，为葡萄酒酿造中的菌株筛选和工艺优化提供了新的见解和工具。

为开展本研究，作者主要采用了以下几项关键技术方法：首先，利用145株L. thermotolerans菌株（根据基因簇分为C1-C6组，包括野生和人工环境来源菌株）及一株S. cerevisiae对照菌（AWRI796）进行表型筛选；其次，通过最小抑制浓度（MIC）测定和生长参数分析（包括延滞期、最大生长速率和生长效率）评估菌株对10种代谢抑制剂的敏感性；第三，选择代表性抑制剂（OXA、MET、DSF及其组合）进行发酵实验，利用酶法分析仪和红外分析仪测定代谢物（如乳酸、乙酸、甘油、乙醇、pH等）变化；最后，采用RNA测序技术（Illumina NovaSeq X Plus）进行转录组分析，通过差异表达基因（DEGs）和KEGG富集分析解析代谢通路调控机制。样本队列包括野生和人工环境来源菌株，覆盖了该物种的遗传多样性。

3.1. MIC determinations, growth parameters and cluster analysis

通过测定最小抑制浓度（MIC），作者发现azide（AZS）和disulfiram（DSF）的抑制效力最强（MIC分别为0.1 μM和3.9 μM）。生长参数分析表明，野生型菌株对oxamate（OXA）、metformin（MET）和disulfiram（DSF）更敏感，其生长效率和最大生长速率显著低于人工环境来源菌株（如葡萄酒相关菌株，集群C4-C6）。主成分分析（PCA）显示，延滞期是区分菌株响应差异的最主要参数。这些结果说明，人工环境菌株具有更强的代谢稳健性，OXA抗性可作为筛选高性能产酸酵母的实用标记。

3.2. Fermentation kinetics and metabolite analysis

发酵代谢物分析显示，OXA及其与DSF的组合处理显著降低了乳酸产量（在L. thermotolerans Lt106中分别从17.12 g/L降至8.75 g/L和8.67 g/L）和总酸度（降幅达26%），同时提高了pH和琥珀酸水平，而不影响乙醇产量。MET处理则大幅提升乙酸（+319%）和甘油（+25%）产量。在S. cerevisiae中，MET和DSF+MET处理导致pH显著上升（从3.57至4.26），总酸度下降。这些结果表明，抑制剂处理可有效重定向碳代谢流，改变葡萄酒的酸度平衡和风味成分。

3.3. Transcriptomic responses to inhibitors

转录组分析揭示，OXA及DSF+OXA处理引发了最显著的基因表达变化，在S. cerevisiae中分别有15%和13%的基因上调和下调，L. thermotolerans中也观察到类似趋势。OXA处理后，L. thermotolerans中LDH2（乳酸脱氢酶基因）和部分糖酵解基因下调，而GPD1（甘油-3-磷酸脱氢酶基因）和氧化磷酸化基因上调。MET引起中度转录重编程，涉及氨基酸生物合成和能量代谢通路。DSF单独作用影响较小，但与OXA组合时协同增强了对代谢网络的扰动。两种酵母的响应策略不同：S. cerevisiae优先调控核糖体生物合成和翻译过程，而L. thermotolerans更注重能量代谢和氧化应激的适应。

研究结论与讨论部分强调，本研究通过化学抑制与多组学整合分析，揭示了L. thermotolerans代谢可塑性的分子基础。OXA抑制LDH后，乳酸合成减少，碳流转向琥珀酸和甘油途径，同时转录层面伴随LDH下调、GPD1上调和氧化磷酸化基因激活，说明酵母通过冗余代谢通路维持 redox（如NAD⁺/NADH）平衡。野生型与人工环境菌株的表型差异反映了其生态适应性与代谢进化背景，葡萄酒相关菌株（C4-C6集群）在抑制剂压力下表现出的生长优势与产酸能力，为其工业应用提供了直接依据。

该研究的重要意义在于：第一，开发了一种基于代谢抑制剂的表型筛选方法，可高效鉴定具有优良酿造特性的酵母菌株；第二，明确了OXA作为代谢标记物在酵母选育中的实用价值，通过抑制LDH活性可精准调控酸度，提升葡萄酒的新鲜感与平衡性；第三，揭示了L. thermotolerans与S. cerevisiae在代谢应激响应中的策略差异，为合成微生物组(synthetic microbial communities)的设计提供了参考；第四，为葡萄酒酿造中的精准发酵控制提供了新思路，可通过抑制剂辅助策略优化工艺参数，改善酒质。未来研究可进一步探索抑制剂在真实酿酒环境中的应用潜力，并结合代谢工程手段构建高性能酵母菌株，推动葡萄酒产业的可持续发展。