硫酸化水平调控硫酸葡聚糖增强卵转铁蛋白热稳定性的分子机制：结构解析与动力学模拟

本研究发现不同硫酸化程度的硫酸葡聚糖（DXS）通过分子伴侣样作用抑制卵转铁蛋白（OVT）热诱导无定形聚集，显著提高其热稳定性。研究结合光谱学分析、热位移实验（thermal shift assay）和分子动力学模拟，揭示DXS通过静电相互作用和氢键优先结合于OVT特定口袋区域（ASN-672/TRP-464/SER-674），促进柔性环向稳定螺旋结构转化，为多糖介导的蛋白质稳定机制提供新见解。

　　

Highlight

硫酸化多糖作为分子伴侣样剂可增强卵转铁蛋白（OVT）的热稳定性，但硫酸葡聚糖（DXS）的作用机制尚不明确。本研究合成三种硫酸化程度（0.3、1.0和2.1）的DXS，通过分子动力学模拟揭示其与OVT的特异性相互作用。浊度、粒径分布和形态学结果表明，DXS以硫酸化依赖性方式有效抑制OVT热诱导无定形聚集，并促进可溶性寡聚结构形成。热位移分析进一步显示DXS显著延迟OVT熔解温度（T_m），在DXS 1.0时提高22.8%，在DXS 2.1时超出仪器检测限。光谱表征表明DXS（尤其是DXS 2.1）在热处理中良好保持OVT二级和三级结构，且硫酸取代度越高稳定效果越强。分子动力学模拟识别出一个由ASN-672、TRP-464和SER-674残基形成的口袋优先结合位点，DXS结合促进柔性环区转化为稳定螺旋结构。静电相互作用和氢键主导DXS与OVT的结合。

Materials

鸡卵白来源的卵转铁蛋白（OVT，脱铁形式，≥98%，C0755）和葡聚糖（DX，500 kDa）购自Sigma Chemical Co.，其他试剂为分析纯。

Dextran sulfates (DXS) preparation and characterization

采用氯磺酸-吡啶（CSA-Pyr）法通过硫酸化葡聚糖（DX）制备DXS（Jin, Lu, Huang, Wang, & Wang, 2011）。首先将氯磺酸（CSA）和无水吡啶（Pyr）按体积比24:3、24:6和24:9混合形成磺化试剂，然后加入DX（500 mg），并于90°C反应3小时。反应结束后，用氢氧化钠溶液中和至pH 7.0，并通过透析和冻干获得纯化产物。采用元素分析仪测定硫含量，并计算硫酸取代度（DS_S）。

DXS characterization

本研究通过CSA-Pyr法合成DXS，该方法因能实现高取代度（DS_S）、优异产率且易于回收而被广泛采用（Jin, Lu, Huang, Wang, & Wang, 2011）。通过调整CSA/Pyr比例（24:3、24:6和24:9）获得三种不同DS的DXS样品。DX及三种DXS样品的视觉外观如图S1所示，呈清澈透明溶液状。元素分析结果显示三种DXS的DS_S分别为0.3、1.0和2.1（表S1），表明成功合成了不同硫酸化程度的DXS。FT-IR光谱进一步证实硫酸基团的成功引入（图S2）。

Conclusion

本研究合成了三种硫酸取代度（0.3、1.0和2.1）的DXS，并深入探讨了DXS影响OVT热稳定性的分子机制及构效关系。宏观分析（浊度、可溶性蛋白、DLS和TEM）证实DXS发挥分子伴侣作用，以硫酸化依赖性方式抑制OVT热诱导聚集并促进可溶性寡聚体形成。热位移实验显示DXS显著提高OVT的T_m，且效果随硫酸化程度增加而增强。光谱学结果表明DXS（尤其是高硫酸化样品）在热处理中有效维持OVT的二级和三级结构。分子模拟进一步揭示DXS通过静电作用和氢键优先结合于OVT特定结构域，诱导柔性环区构象转变，为硫酸化多糖作为蛋白质热保护剂的应用提供理论依据。