PADI4介导的瓜氨酸化修饰调控毛囊发育中祖细胞增殖与翻译的新机制

本研究针对毛囊发育过程中祖细胞状态转换的调控机制，聚焦于瓜氨酸化酶PADI4的功能解析。通过单细胞测序、体内外功能实验及蛋白质组学分析，发现PADI4通过抑制LEF1+祖细胞增殖和蛋白质翻译活性，负向调控毛囊发育。该研究揭示了PADI4-4E-BP1互作调控翻译起始的新通路，为组织发育中转录后修饰调控机制提供了重要见解。

　　

在组织发育和再生过程中，祖细胞的增殖与分化平衡需要精确的调控。除了经典的转录因子和信号通路，翻译后修饰（PTMs）作为扩展蛋白质功能的重要机制，近年来受到越来越多关注。其中，瓜氨酸化（citrullination）作为一种将精氨酸转化为瓜氨酸的修饰方式，其生物学功能尤其在祖细胞行为调控中的作用尚不明确。

毛囊（HF）发育作为研究祖细胞谱系进展的经典模型，其形态发生始于胚胎期第14天（E14），通过间充质-上皮信号协调祖细胞增殖，最终分化为7种不同的毛囊 lineages。Lef1标记的祖细胞 committed to 毛干（HS） lineages，而Gata3则标记内根鞘（IRS） lineages的祖细胞。瓜氨酸化由钙离子依赖的肽基精氨酸脱亚胺酶（PADIs）家族催化，其中PADI4与干细胞自我更新和癌症发生相关，但其在组织发育中的具体功能机制仍有待阐明。

为了回答这些问题，研究人员利用K14-Cre;tdTomato;Padi4^fl/fl条件性基因敲除小鼠模型，结合单细胞RNA测序、免疫荧光染色、体内外增殖与翻译检测、蛋白质组学分析以及分子互作实验，系统解析了PADI4在毛囊发育中的功能机制。

研究主要采用以下关键技术方法：1）利用K14-Cre;Padi4^fl/fl小鼠模型构建皮肤特异性PADI4条件性敲除体系；2）通过荧光激活细胞分选（FACS）和单细胞RNA测序技术解析毛囊细胞异质性和基因表达谱；3）运用RNAscope原位杂交和免疫荧光染色进行时空表达分析；4）采用O-propargyl-puromycin（OPP）和5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU）标记检测体内外蛋白质翻译和细胞增殖；5）通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术鉴定瓜氨酸化修饰组；6）利用报告基因实验和分子互作分析研究信号通路调控机制。

PADI4在发育中毛囊的表达

单细胞测序分析显示Padi4在祖细胞群（GL和LPC）和分化细胞群（Med、Cx、IRS）中均有表达。RNAscope证实PADI4在胚胎期E18.5均匀低表达，出生后P0时期在形成中的髓质和毛管中富集，P1时期在所有内层毛囊 lineages中表达增加。成年生长期毛囊中，PADI4在毛球部祖细胞和分化 lineages中持续表达。

PADI4缺失诱导基因表达

PADI4条件性敲除（cKO）毛囊细胞中，差异表达基因分析显示六个主要细胞群中上调基因数量显著多于下调基因，提示PADI4可能作为转录共抑制因子发挥作用。特别在LPC祖细胞群中，细胞周期相关基因（Pcna、Lef1、Mcm5）显著上调。

PADI4限制LEF1阳性祖细胞增殖

PADI4 cKO毛囊在E18.5时期显示LEF1⁺细胞数量增加，但GATA3⁺细胞数量无变化。EdU标记显示E18.5时期增殖显著增加，特别在LEF1⁺/EdU⁺双阳性细胞中，而GATA3⁺ lineage中无此现象。成年毛发长度测量显示PADI4 cKO小鼠毛干长度显著增加。

PADI4不影响毛干分化

AE13（K40）染色显示P1时期PADI4 cKO毛干分化增强，但IRS分化标记AE15无变化。伪时间分析表明PADI4缺失不影响祖细胞向各 lineages的分化轨迹，主要影响增殖而非分化进程。

PADI4过表达抑制祖细胞增殖

体外实验证实PADI4 cKO表皮祖细胞增殖增加，而PADI4过表达（OE）则抑制增殖，验证了PADI4对增殖的负向调控作用。

PADI4靶向RNA加工和翻译相关蛋白

蛋白质组学鉴定出151个瓜氨酸化蛋白，其中110个为PADI4依赖性。STRING互作网络分析显示这些蛋白富集于翻译起始因子（eIF2α、eIF3b、eIF3i）、RNA解旋酶（DHX9、DDX3X）和剪接因子（RBM39、SFPQ）。GO分析证实这些蛋白与RNA加工、剪接和翻译过程相关。

PADI4缺失促进核糖体生物发生

PADI4 cKO祖细胞中核糖体生物发生和rRNA加工相关蛋白上调。体内外实验显示PADI4 cKO细胞中47S pre-rRNA转录和RPL26蛋白表达均增加，表明核糖体生成加速。

PADI4负向调控蛋白质合成

OPP标记显示PADI4 cKO祖细胞翻译速率增加，而PADI4 OE细胞翻译抑制。体内实验证实PADI4 cKO毛囊中翻译活性增强，且增殖细胞（Ki67⁺）中翻译活性更高。

PADI4缺失影响经典翻译调控通路

Western blot分析显示PADI4 cKO细胞中Akt（S473）和mTOR（S2448）磷酸化增强，下游p70S6K（T389）和S6（S240/244）磷酸化水平升高。然而4E-BP1总蛋白和磷酸化（S65）水平均下降，eIF4E表达也降低，提示PADI4缺失通过非经典方式激活帽依赖性翻译。

PADI4结合并瓜氨酸化4E-BP1

实验证实PADI4与4E-BP1直接互作，体外瓜氨酸化实验证明PADI4能催化4E-BP1 R62位点瓜氨酸化。R62K突变体显示S65磷酸化水平降低，表明瓜氨酸化与磷酸化修饰存在交叉对话。

研究表明PADI4通过限制LEF1阳性祖细胞增殖和调控翻译活性，在毛囊发育中发挥重要作用。机制上，PADI4通过瓜氨酸化修饰靶向RNA加工和翻译相关蛋白，抑制核糖体生物发生和蛋白质合成。特别发现PADI4直接结合并瓜氨酸化翻译抑制因子4E-BP1，影响其磷酸化状态，揭示了瓜氨酸化在翻译调控中的新功能。

该研究首次系统阐明了PADI4在毛囊发育中的功能机制，将蛋白质瓜氨酸化修饰与祖细胞增殖和翻译调控相联系，为组织发育和再生领域提供了新的分子机制见解。研究结果不仅深化了对毛囊生物学的理解，也为相关疾病如脱发症和癌症的治疗提供了潜在靶点。

论文发表于《SCIENCE ADVANCES》，为蛋白质翻译后修饰调控组织发育的研究提供了重要范例，展示了多组学技术结合功能实验在机制研究中的强大优势。