中亚鼠疫耶尔森菌全基因组测序揭示宿主与环境适应性塑造基因型的机制

本研究通过对中亚自然疫源地98株鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）进行全基因组测序，开发了针对染色体和质粒的高精度组装流程，建立了包含99个诊断性多态性位点的分型体系，成功区分了沙漠与高原来源的Medievalis（2.MED）优势菌株。研究发现napA、araC、ssuA、rhaS等基因多态性及转座子/CRISPR-Cas插入模式可作为生物型标识，并首次在乌拉尔-恩巴地区2.MED1菌株中检测到高加索地区2.MED0特有的新型隐秘质粒pCKF，表明质粒跨谱系水平转移。该研究强调了基因组监测对追踪毒力相关遗传元件传播的重要性，为鼠疫防控提供了分子流行病学新策略。

　　

引言

鼠疫作为人类历史上最致命的传染病之一，曾引发三次大流行：查士丁尼瘟疫（541–542 CE）导致约2500-5000万人死亡，黑死病（1347–1351 CE）造成7500万-2亿人死亡，第三次大流行（1855–1959）仅在印度和中国就导致1200万人死亡。研究表明这些大流行分别由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的Antiqua（ANT）、Medievalis（MED）和Orientalis（ORI）生物型引起。传统生物型分类基于生化特性（如甘油发酵和硝酸盐还原能力）和遗传差异，但近年来全基因组测序技术为精准分型提供了新方案。

材料与方法

从哈萨克斯坦国家特别危险微生物保藏中心（NCMO）选取98株1961-2022年间分离自中亚不同疫源地的耶尔森菌株，涵盖沙漠、高原等12个自治疫源地。采用MiSeq平台进行全基因组测序，开发了结合参考序列比对和de novo组装的ILLAMINA和YPPA分析流程。使用Python3脚本yp_classifier进行多态性位点筛选和统计验证，通过随机森林分类器（RandomForestClassifier）、PERMANOVA和Mantel检验评估分支分离显著性。

结果

菌株鉴定与生物型分析

通过传统微生物学检测（包括噬菌体裂解试验、糖发酵和硝酸盐还原试验）结合全基因组测序，确认大多数菌株属于MED生物型。发现关键基因多态性特征：

• •

  ilvN基因3'端45 bp缺失区分主要与非主要生物型

• •

  glpD基因93 bp缺失标志ORI生物型（本研究未发现）

• •

  napA基因613位G→T突变导致提前终止密码子，与MED生物型硝酸盐还原能力缺失相关

• •

  araC基因773位G插入及rhaS基因671位A/G多态性用于区分高原适应性菌株

诊断性多态性位点panel

通过比对耶尔森菌参考基因组（Y. pseudotuberculosis IP 32953），筛选出99个高变异位点构建0/1矩阵。Camin-Sokal简约算法聚类显示MED菌株明确分为沙漠分支（n=37）和高原分支（n=47）。随机森林分类交叉验证准确率达98.89%，PERMANOVA（F=21.959）和Mantel检验（r=0.2707）证实分支分离显著性。基因流分析表明高原向沙漠的基因渗入频率（20.8%-45.8%）显著高于反向（4.7%-26.6%）。

质粒与可移动遗传元件

典型耶尔森菌携带3个毒力质粒：pMT1（96-101 kb，编码F1荚膜和Ymt毒素）、pCD1（70 kb，编码III型分泌系统）和pPCP1（9.6 kb，编码Pla蛋白酶）。测序深度分析显示pPCP1拷贝数最高（平均1608×），提示其高复制特性。首次在乌拉尔-恩巴疫源地菌株42_YP10_UE（沙漠MED分支）中发现高加索地区特有的隐秘质粒pCKF（5.4 kb），该质粒含virB5/virB6等IV型分泌系统基因，可能通过水平转移跨谱系传播。

转座子与CRISPR-Cas分布

鉴定出IS100kyp（IS630家族）、ISEc39（IS481家族）、IS1541B/IS200（IS5家族）等8个转座子家族。主要生物型菌株含134-144个插入，而Y. pseudotuberculosis相关菌株仅37-38个。IS3家族成员（IS1661、IS1222等）分布模式具有生物型特异性：

• •

  MED/ANT菌株呈现8个IS1661插入和单一其他IS元件

• •

  塔拉斯菌株特有ISVisp4插入

• •

  菌株48_YP14_PAK和SCPM-O-B-6899显示独特CRISPR-Cas重复序列缩短现象

讨论

本研究揭示了中亚地区耶尔森菌种群结构的生态适应性分化特征。MED生物型沙漠与高原分支的形成主要源于对不同宿主（沙鼠与旱獭）和环境条件的适应性进化，而非严格的系统发育关系。多态性位点分布显示显著的趋同进化特征，如菌株57_YP22_IM和19_YP74_IM虽基因组结构类似Y. pseudotuberculosis，但多态性模式与MED菌株聚类，证实生态选择压力主导基因型分化。

pCKF质粒在遗传无关菌株间的发现警示了可移动遗传元件在疫源地的传播风险。虽然其与毒力关联尚未明确，但含IV型分泌系统基因提示潜在适应性优势。转座子分布模式为生物型鉴定提供新依据，但不宜用于系统发育推断因缺乏进化模型支持。

结论

本研究通过全基因组测序技术解析了中亚鼠疫耶尔森菌的遗传多样性特征，建立了基于99个多态性位点的分型体系，成功区分生态适应性差异的沙漠与高原MED分支。发现质粒pCKF跨谱系传播证据，强调可移动遗传元件在病原体进化中的重要作用。提出的基因组监测策略和生物信息学流程（yp_classifier等）为鼠疫分子流行病学监测和疫情预警提供了技术支撑，对应对气候变化和人类活动影响下的鼠疫防控具有重要意义。