基于逆转录重组酶辅助扩增技术（RT-RAA）联合侧向流层析试纸条（LFD）的低资源兼容型基孔肯雅病毒快速诊断平台的开发与概念验证

《PLOS Pathogens》：Development and proof of concept evaluation for a low resource compatible Chikungunya virus diagnostic

本刊推荐：本研究开发了一种基于逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与侧向流层析试纸条（LFD）联用的基孔肯雅病毒（CHIKV）快速诊断平台（Iso-CHIKV-Dx）。该平台采用新型样本处理试剂（TNA-Cifer-E）实现室温2分钟病毒灭活与RNA提取，靶向高度保守的E1基因区域，具备优异特异性（不交叉检测相关甲病毒/黄病毒）与灵敏度（尿样中570拷贝/μL）。全程无需复杂仪器，30分钟内完成检测，为资源匮乏地区的CHIKV防控提供高效技术方案。

　　

摘要

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种正链RNA甲病毒，持续对全球公共卫生构成重大威胁。该病毒主要通过伊蚊属蚊子传播，但也存在输血和垂直传播（母婴传播）途径。目前仅有一种获批疫苗且无特效药物，早期检测对控制CHIKV疫情至关重要。本研究设计并评估了一种灵敏特异的CHIKV诊断方法，采用逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）耦合侧向流层析试纸条（LFD）检测技术，靶向CHIKV E1基因的高度保守区域。结果显示，使用简易样本处理试剂（TNA-Cifer-E）可在室温下两分钟内灭活活病毒，同时保持病毒RNA完整性。特异性分析表明，Iso-CHIKV-Dx不与近缘甲病毒及常见共循环黄病毒发生交叉反应。在掺有CHIKV的尿样概念验证实验中，该检测体系可在等温条件下30分钟内检测低至570拷贝/μL的CHIKV RNA。与传统RT-qPCR相比，本方法无需昂贵仪器、先进设备或经过严格培训的人员，检测速度提升四倍。临床前评估表明，Iso-CHIKV-Dx有望成为稳健的床旁检测工具，在替代或缺乏RT-qPCR的场景中发挥重要作用。

作者摘要

多家全球卫生组织（WHO、CDC、EMA等）均担忧下一次大流行可能由虫媒病毒引起。基孔肯雅病毒（CHIKV）等虫媒病毒的出现与再现因全球化、大规模扩张、城市化加速和气候变化等因素而备受关注。目前仍缺乏针对CHIKV的特效药物，快速诊断与早期检测仍是预防和控制疫情的关键措施。CHIKV疫情多发生于偏远农村地区，这些地区常缺乏资源和专业技术人员。本研究开发并评估了一种无需先进仪器或经验人员的潜在床旁快速诊断工具。这种虫媒病毒检测新策略可为快速诊断领域创新及虫媒病毒疫情应对提供重要见解。

引言

近年来致病性虫媒病毒的出现与再现已成为全球公共卫生的重要关切。2022年世界卫生组织（WHO）为此启动"全球虫媒病毒倡议"。在所列的多种虫媒病毒中，基孔肯雅病毒（CHIKV）被列为三大关注病原体之一。CHIKV是一种正链RNA甲病毒，属于披膜病毒科。其感染临床表现包括发热、剧烈关节痛和炎症性肌肉骨骼疾病，导致衰弱性疼痛与不适。虽然CHIKV感染致死率较低，但病毒血症 pathogenesis 已在多种细胞类型中发现，包括树突状细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞和成骨细胞。CHIKV主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊吸血传播给人类，但也存在垂直传播和输血传播病例报道。尽管目前尚无CHIKV特效药，但2024年初美国FDA正式批准了CHIKV疫苗"IXCHIQ"。

CHIKV于1952年首次从坦桑尼亚患者血清中分离，当时患者表现出关节痛样症状。数十年间，CHIKV仅在非洲北部传播，1950年代在泰国和菲律宾有少量聚集病例。2005-06年留尼汪岛发生大规模疫情，三分之一人口（77.5万）感染，237人死亡。CHIKV现已迅速蔓延至六大洲，40多个国家有病例报告。鉴于其全球流行性及缺乏获批药物，早期检测对控制CHIKV疫情至关重要。目前，RNA分离与RT-qPCR被视为CHIKV诊断的金标准方法，但对专业人员、复杂方法和先进仪器（热循环仪）的需求使该技术在资源匮乏地区应用受限。相比之下，无需这些元素的快速等温核酸扩增检测（iNAATs）正获得显著关注。

等温扩增技术如逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）在多种虫媒病毒检测中展现出良好前景，但尚未在CHIKV快速床旁诊断领域得到广泛评估。重组酶辅助扩增（RAA）是一种与RPA相似的iNAAT技术，在传染病诊断领域表现出色。加入逆转录酶（RT）后，RT-RAA在寨卡病毒（ZIKV）等虫媒病毒检测中显示出潜力。RT-RAA具备快速、灵敏的特性，其在等温诊断工具中的应用在尿液样本ZIKV快速检测中表现出优于RT-qPCR的临床前效能。尽管CHIKV药物与疫苗研发持续进行，当前全球公共卫生威胁仍需更直接的疫情控制措施，早期检测与快速诊断仍是关键。

本文报道了一种快速等温CHIKV诊断平台（Iso-CHIKV-Dx）的开发与临床前评估。该平台采用独特的低资源兼容样本处理流程、快速等温（RT-RAA）程序与侧向流层析试纸条（LFD）检测方法，30分钟内即可检测CHIKV感染。这种快速POC式诊断无需实验室经验或昂贵仪器，展现出在资源匮乏地区应对CHIKV感染的良好诊断能力。

方法与材料

质粒与RNA模板制备

含有CHIKV包膜（E1）基因片段（LC500222.1）的质粒（pBIC-A）购自Bioneer Pacific公司。按先前描述方法使用MEGAscript T7转录试剂盒生成RNA转录本。

RAA引物与探针设计

从NCBI GenBank数据库获取代表东中南非（ECSA）、西非、城市亚洲、东南亚、大洋洲、欧洲和美洲谱系的660条CHIKV E1基因序列。使用MAFFT（v7.49）进行多序列比对，识别出141条独特E1序列。通过MAFFT重新比对后，采用IQTREE2构建最大似然（ML）系统发育树，使用最适核苷酸替代模型（TN+F+G4）和10,000次bootstrap重复。引物与探针设计靶向E1基因最保守区域（~2000..2350），并通过oligoevaluator评估二聚体、二级结构和GC含量，最终由Bioneer Pacific合成。

Iso-CHIKV-Dx检测体系

快速样本处理

将CHIKV"毛里求斯株"培养物（2.5×10⁷ FFU/ml）按1:2比例与TNA-Cifer Reagent E混合，室温处理2分钟。模拟尿样进一步用无核酸酶水1:10稀释。

RT-RAA扩增

使用RAA试剂盒进行反应，最终条件为：1×RAA复溶缓冲液，1/5 RAA pellet，正向引物（420 nM），反向引物（420 nM），探针（120 nM），内切酶IV（2 U），M-MLV逆转录酶（60 U），醋酸镁（14 mM）和1 μL模板，总体积10 μL。醋酸镁加至PCR管盖，加入模板后离心，39°C加热块孵育20分钟。

侧向流层析试纸条检测

用0.4%酪蛋白封闭缓冲液预处理HybriDetect试纸条。取2 μL扩增产物加至样品垫，将试纸条置于含80 μL运行缓冲液的EP管中5分钟。使用平板扫描仪扫描图像，经Irfan View 64转换为灰度后导入ImageJ分析，按先前描述方法进行条带强度分析与统计定量。

灵敏度与特异性测试

使用纯化CHIKV E1基因合成RNA转录本的10倍系列稀释液进行分析灵敏度测试。分析特异性测试采用多种病毒株纯化RNA。因CHIKV感染者病毒载量变异大，未设定特定感染模拟值，但CHIKV诊断的基准检测限约为20拷贝/反应。使用合成CHIKV RNA转录本（1×10⁴拷贝/μL）作为阳性对照以确保特异性验证与灵敏度参考。

模拟感染尿样

将CHIKV培养物（2.5×10⁷ FFU/ml）按1:10比例掺入人工尿培养基，最终病毒滴度为2.5×10⁶ FFU/ml。1:10稀释旨在将滴度降至更接近真实世界的浓度。

病毒与细胞培养

本研究所有病毒株均列于表中。CHIKV"毛里求斯株"通过感染C6/36细胞（MOI=0.1）培养8天，离心澄清后收获病毒液保存于-80°C。C6/36细胞按先前描述方法培养。

滴度测定

通过96孔板免疫斑块 assay（IPA）评估CHIKV滴度，使用1:100稀释度的5.5G9鼠单克隆抗体（靶向CHIKV核衣壳）作为一抗。

CHIKV免疫斑块 assay检测限

通过IPA测定系列稀释的CHIKV病毒培养物（2.5×10⁷ FFU/ml），计数斑块后确定检测限为25 FFU/mL（即1.39794 log₁₀ FFU/mL）。

CHIKV灭活测试

用TNA-Cifer Reagent E（TCE）和PBS对照按两种比例（1:1和2:1）处理CHIKV培养物，每个时间点进行三次传代滴定以确定完全灭活条件。

RNA纯化

使用TRIzol纯化病毒分离株RNA，病毒液由合作实验室提供，滴度均≥1×10⁶ FFU/ml。RNA洗脱至50 μL无核酸酶水中保存于-80°C。

CHIKV qRT-PCR

将CHIKV感染尿样加入TRIzol，按上述方法提取纯化RNA。使用Super script III系统以1 μg纯化RNA合成cDNA。实时荧光定量PCR反应含2μL cDNA、10 μL 2×SYBR green预混液、6 μL无核酸酶水和1 μL 10 μM引物，总体积20 μL。在Rotor gene 6000上运行条件：95°C 2分钟，94°C 5秒、60°C 10秒、72°C 30秒共45循环，通过熔解曲线确认产物。所有样本设三个复孔，数据经软件分析。

结果

分析灵敏度与特异性

通过靶向所有已知CHIKV谱系E1基因高度保守区域的设计，RT-RAA assay对系列稀释纯化CHIKV RNA转录本的检测限为750 RNA拷贝/μL。基于侧向流试纸条扫描图像的像素密度分析提供了可量化的检测数值。特异性评估显示，Iso-CHIKV-Dx对六种常见甲病毒（ONNV、SINV、SFV、RRV、BFV、MAYV）及共循环黄病毒（ZIKV、JEV、DENV 1-4型）均无交叉反应，特异性达100%。

样本处理灭活CHIKV

评估表明，TNA-Cifer Reagent E（TCE）作为样本处理试剂可有效灭活CHIKV并提取可行病毒RNA。CHIKV"毛里求斯株"（2.5×10⁷ FFU/mL）在1:1（TCE:CHIKV）比例下即时暴露（0分钟）即完全灭活，1:2比例下1分钟后完全灭活。

合成尿样中CHIKV检测

采用掺有CHIKV（毛里求斯株）的人工尿样模拟临床样本。尽管1:1和1:2比例在2分钟均实现完全灭活，选择1:2比例5分钟处理以确保更高RNA完整性并减少抑制剂可能。与qRT-PCR平行比较显示，Iso-CHIKV-Dx对活CHIKV的检测限为2.5×10³ FFU/mL，对应Ct值30.36和1,140拷贝/反应。因RT-qPCR使用2μL模板，等效检测限为570拷贝/μL CHIKV RNA。全程耗时30分钟，较常规RNA提取与RT-qPCR（2.5小时）快四倍。

讨论

尽管美国已批准CHIKV疫苗，但许多CHIKV流行地区尚未批准，加之缺乏可用药物，CHIKV仍对全球多地人群构成健康风险。由于CHIKV感染多发生于缺乏经验医护人员与基础设施的偏远热带地区，iNAATs等简单床旁诊断策略比RT-qPCR等常规方法更具实用兼容性。

本研究开发的新型iNAAT（Iso-CHIKV-Dx）结合快速低资源兼容样本处理流程、RT-RAA与侧向流检测，实现了30分钟内尿样CHIKV高效检测。分析灵敏度达750拷贝/μL（基于E1基因RNA转录本），符合先前描述的等温法CHIKV检测基准（20-200拷贝/反应）。100%特异性确保不与近缘甲病毒（特别是遗传高度相似的ONNV）及共循环黄病毒交叉反应。使用活病毒人工尿样检测限为2.5×10³ FFU/mL，对应570拷贝/μL RNA与Ct值30.36。

TNA-Cifer Reagent-E此前已证明可有效灭活ZIKV、Nipah病毒、Hendra病毒和DENV，同时保证病毒RNA提取。本研究数据显示该试剂同样有效灭活CHIKV并提取可行病毒RNA用于检测。30分钟全程耗时较RNA提取与RT-qPCR（2.5小时）显著缩短，展现出适合资源匮乏地区的快速床旁诊断品质。活CHIKV检测灵敏度（570 RNA拷贝/μL）与一步法实时RT-LAMP CHIKV assay（报道灵敏度1,000拷贝/反应）高度相当。虽另有RT-LAMP研究报道血清样本检测灵敏度达12拷贝/反应，但LAMP assay需多引物设计，对高变异RNA病毒可能存在设计难题。相比之下，Iso-CHIKV-Dx采用快速简单样本处理、更少步骤（无需RNA纯化）、39°C恒温30分钟出结果。此外，RT-RAA对PCR抑制剂具有高耐受性，使本检测更符合R.E.A.S.S.U.R.E.D标准（实时连接、样本采集简便、可负担性、灵敏度、特异性、用户友好、快速、设备可靠及终端可及性）。

因生物安全与检疫限制，未能评估更多活CHIKV毒株，但广泛系统发育分析表明引物探针可退火所有已知CHIKV毒株E1基因靶标，且靶标区域高度保守提示E1基因进化可能性低。

RT-qPCR可能仍是具备先进病理实验室与训练人员地区的首选诊断技术。虽尿液可保存可行CHIKV RNA达95天，但血液、血清和精液是RT-qPCR诊断最常用临床基质。这些基质中RT-qPCR典型检测范围为5-100 RNA拷贝/反应。尽管灵敏度高，但CHIKV疫情多发生于农村偏远地区，RT-qPCR对昂贵热循环仪、专业经验、高成本试剂与严格储存的要求使其在资源匮乏环境应用受限，iNAATs诊断方法更适配此类场景。

虽实施基本模拟读取设备实现"实时连接"可能存在小障碍，但简易口袋扫描仪即可满足需求。未来计划通过现场评估验证临床效能，并通过测试不同谱系CHIKV毒株验证普适性，目标获取真实临床样本进行模拟实验室测试或在CHIKV散发地区部署检测。

因检测需人工步骤，应承认其大规模临床样本筛查速度不及RT-qPCR。但相较RT-qPCR，Iso-CHIKV-Dx专为现场兼容设计，需最少资源、无先进仪器与病理学专业知识。数据显示较RT-qPCR（通常2.5小时）提速四倍，样本处理至结果30分钟内完成。虽不意图替代RT-qPCR，但具备作为潜在预筛工具的属性，特别适用于资源匮乏地区CHIKV聚集性疫情早期检测。与其他现场NAATs类似，可能面临扩增后交叉污染风险，解决方案可包括用dUTP替代dTTP（LAMP assay中已证明减少交叉污染），或采用一次性检测卡盒（已证明有效减少污染）。承认本研究样本量有限，但方法学新颖性更侧重概念验证，未来方向正探索用真实患者样本进行临床前评估。

虫媒病毒如CHIKV的早期检测对缓解潜在疫情与防止社区传播至关重要，尤其在缺乏诊断工具、治疗与临床应对能力的资源有限地区。拥有合适临床检测工具的同时，监测与 surveillance 更应优先。虽不太可能替代RT-qPCR等方法，但在严重缺乏基础设施地区部署Iso-CHIKV-Dx可作为感染一线指示工具辅助疫情控制。如前所述，CHIKV主要经两种伊蚊传播，但气候变化与城市扩张增加了CHIKV等虫媒病毒的媒介适性，成为日益关注的领域。因此，提供稳健快速结果的POC与现场可部署assay对CHIKV传播监测极具价值。进一步研究 warranted 评估本检测作为媒介监测工具的潜力，通过测试蚊子等媒介。除临床试验探索外，目标评估Iso-CHIKV-Dx在蚊子检测中的性能。

结论

本研究开发并评估了一种临床前CHIKV诊断平台，需39°C孵育，30分钟内产生实时诊断结果。临床前评估显示对CHIKV新型检测方法具备 promising 创新性。检测体系可检测低至750拷贝/μL合成RNA，且不非特异检测甲病毒或黄病毒。使用TNA-Cifer Reagent-E成功在室温2分钟内灭活活CHIKV（毛里求斯株）并提取可行病毒RNA。通过结合优化样本处理流程、RT-RAA与侧向流检测，开发出稳健CHIKV检测平台。相较"金标准"qRT-PCR，Iso-CHIKV-Dx对活CHIKV（毛里求斯株）检测限为2.5×10³ FFU/mL，对应Ct值30.36，尿样中每反应检测1,140拷贝CHIKV RNA。因检测体系通用简洁，其实际应用超越临床诊断，有望成为监测传播CHIKV与其他虫媒病毒媒介的合适工具。