基于比率型荧光适配体传感器与EXPAR信号放大技术实现食品中单增李斯特菌的超灵敏检测

本研究针对食品中单增李斯特菌（LM）污染快速检测的难题，开发了一种基于FRET和EXPAR信号放大的比率型荧光适配体传感器。该传感器实现了0.56 CFU/mL的检测限与101–106 CFU/mL的宽线性范围，并在实际样本中回收率达87.1–101.9%，为食品病原体检测提供了高灵敏度、高可靠性的新方法。

　　

在当今全球食品安全形势日益严峻的背景下，食源性病原体污染已成为威胁公共健康与社会经济的重大隐患。其中，单增李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）因其高致病性与高死亡率备受关注。它不仅能在食品加工和储存环境中长期存活，还可引发从肠胃炎到脑膜炎等多种严重疾病，死亡率高达30%。因此，发展快速、准确、高灵敏的LM检测技术对保障食品安全具有迫切现实意义。

传统的LM检测方法包括培养法、免疫分析法（如ELISA）、分子生物学技术（如PCR、qPCR）等，虽然具有一定的准确性，但往往操作繁琐、耗时长，且易受复杂食品基质干扰，难以满足现场快速检测的需求。近年来，基于核酸适配体（Aptamer）的生物传感器因其高亲和力、易修饰、稳定性好等优势成为研究热点。尤其是荧光适配体传感器，凭借其操作简便、灵敏度高、重现性好等特点显示出巨大潜力。然而，常规荧光传感器多依赖单一信号变化，易受到环境、仪器或操作波动的影响，产生假阳性或假阴性结果。

为解决上述问题，浙江科技大学生物与化学工程学院的王飞飞等研究人员在《Journal of Future Foods》上发表了一项创新研究成果。他们成功构建了一种结合指数扩增反应（EXPAR）与荧光共振能量转移（FRET）机制的比率型荧光适配体传感器，实现了对LM的超灵敏、高特异性检测。

该研究主要依托以下几项关键技术：

一是磁珠分离技术。利用链霉亲和素修饰的磁珠（SA-MBs）固定生物素标记的LM特异适配体，实现目标菌的高效捕获与分离；

二是EXPONENTIAL扩增反应（EXPAR）。通过Nt.BstNBI核酸内切酶和Vent (exo-) DNA聚合酶的作用，实现目标序列的指数级扩增，极大提升检测灵敏度；

三是DNA开关探针设计与FRET信号转换。研究人员设计了一段同时标记Cy3和Cy5荧光基团、并带有淬灭基团的发夹结构DNA探针。当EXPAR产物与探针结合后，发夹打开，Cy5荧光恢复，Cy3作为参比信号，通过计算Cy5/Cy3的荧光强度比值实现比率型检测，有效避免假信号干扰。

在系统优化实验条件后，该传感器在LM浓度为10¹–10⁵ CFU/mL范围内表现出良好的线性关系，检测限低至0.56 CFU/mL，量化限为1.7 CFU/mL，灵敏度显著优于此前报道的多数荧光或电化学传感器。

在特异性验证中，该传感器对LM显示出高度特异性。即使在与金黄色葡萄球菌（S. aureus）、沙门氏菌（S. typhimurium）、荧光假单胞菌（P. fluorescens）和副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）等常见食源性病原体共存的条件下，仍能准确识别LM，未出现明显交叉反应。

为评估其在实际样本中的适用性，研究团队在牛奶、鱼肉、虾肉和鸡肉等真实食品样本中进行了加标回收实验。结果显示，回收率在87.1%至101.9%之间，相对标准偏差（RSD）较小，说明该方法抗干扰能力强，适用于复杂食品基质的检测。

此外，该传感器还表现出良好的重复性与稳定性。批内与批间精密度试验中，RSD分别控制在2.35%–2.74%与3.89%–7.39%之间，符合定量检测要求。

综上所述，该研究通过巧妙的分子设计将EXPONENTIAL扩增反应、FRET能量转移与比率荧光检测策略相结合，成功构建了一种新型LM检测适配体传感器。其不仅具备极高的灵敏度与特异性，还在实际样本中表现出优异的准确度与稳定性，为食品中病原微生物的快速筛查提供了可靠平台。这一技术未来有望推广至其他食源性致病菌的检测体系中，具有重要的应用前景和商业化潜力。