莱茵衣藻磷酸丙糖异构酶S-亚硝基化修饰的分子机制与氧化还原调控研究

本研究揭示了硝基谷胱甘肽（GSNO）通过氧化还原修饰莱茵衣藻磷酸丙糖异构酶（CrTPI）的Cys219位点，调控其催化活性的分子机制。研究人员结合分子模拟、晶体结构分析和突变体功能验证，发现Cys219是GSNO依赖性抑制的关键残基，而Cys14虽可被修饰但不直接参与活性调控。该研究为理解光合生物碳代谢的氧化还原调控提供了新视角，并提示了一种与人类TPI保守的调控策略。

　　

在光合生物和哺乳动物细胞中，蛋白质的S-亚硝基化（S-nitrosylation）作为一种重要的氧化还原依赖性翻译后修饰，通过形成亚硝基硫醇（-SNO）动态调控蛋白质功能与稳定性，参与细胞信号转导和应激响应。硝酸还原酶代谢产生的 nitric oxide（NO）及其载体分子硝基谷胱甘肽（GSNO）是介导这一修饰过程的关键因子。磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase, TPI）是糖酵解和卡尔文-本森循环中的核心酶，催化二羟基丙酮磷酸（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（G3P）的可逆异构化反应。尽管前期蛋白质组学研究已在多种植物和非植物系统中鉴定出TPI为潜在的S-亚硝基化靶标，但其修饰位点、结构基础及功能影响仍不明确。

为阐明这一科学问题，来自意大利博洛尼亚大学的研究团队在《Plant Science》发表了题为“Molecular and structural basis for nitrosoglutathione-dependent redox regulation of triosephosphate isomerase from Chlamydomonas reinhardtii”的研究论文。该研究以模式绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的叶绿体TPI（CrTPI）为对象，综合运用结构生物学、生物化学和计算生物学方法，揭示了GSNO通过修饰Cys219介导酶活性调控的分子机制，并发现其与人类TPI（HsTPI）存在保守的调控模式。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过分子对接（AutoDock VINA）预测GSNO与CrTPI的潜在结合位点；利用分子动力学模拟（AMBER 22）和MM-GBSA（Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area）能量分解分析评估亚硝基硫醇的稳定性；借助X射线晶体学解析GSNO处理后的CrTPI三维结构（分辨率为1.20–1.55 ?）；通过定点突变（C14S和C219S）和体外酶活测定分析突变体对GSNO和DTNB（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)）的敏感性；使用圆二色谱和凝胶过滤色谱评估蛋白质二级结构和寡聚状态。

3.1. Conservation, accessibility, and reactivity of cysteine residues in TPI from Chlamydomonas reinhardtii

CrTPI为同源二聚体，每个亚基含5个半胱氨酸残基（Cys14、Cys126、Cys194、Cys219和Cys247）。序列比对显示，仅Cys126和Cys219在人类TPI中保守。尽管晶体结构分析表明仅Cys219溶剂可及，但DTNB滴定实验显示还原态CrTPI中约4个巯基可被修饰，提示蛋白质在溶液中具有动态构象灵活性。

3.2. Docking analysis reveals that GSNO can potentially interact with two CrTPI sites located in proximity of Cys14 and Cys219

分子对接结果表明，在二聚体构象中，GSNO优先结合于Cys219附近（结合能ΔG_binding = -16.6 kcal mol^-1）；而在单体构象中，Cys14周围形成另一个更优结合位点（ΔG_binding = -18.4 kcal mol^-1）。

3.3. Crystal structure of S-nitrosylated CrTPI reveals the presence of a nitrosothiol at Cys14

通过解析GSNO浸泡（GSNO-soaked）的CrTPI晶体结构，发现在Cys14位点存在明确的亚硝基硫醇电子密度，该修饰基团采取双构象，并通过氢键和π堆积作用与相邻亚基的Val78、Ser79等残基稳定相互作用。未在其他半胱氨酸位点（包括Cys219）观察到修饰信号，推测晶体堆积可能限制了Cys219的可及性。

3.4. Functional and structural features of CrTPI mutants lacking Cys14 and Cys219

C14S和C219S突变体均保持二聚体构象和二级结构完整性。C14S突变导致酶活性降低约20%，可能源于其邻近催化残基Lys13及二聚界面柔性下降；C219S则完全保留野生型活性。

3.5. Redox response of CrTPI WT and Cys variants to oxidative treatments

DTNB处理实验显示C219S突变体对氧化修饰的敏感性显著降低。GSNO处理时，野生型CrTPI活性抑制约50%，C14S突变体抑制程度加剧（达80%），而C219S突变体完全丧失GSNO敏感性，证明Cys219是GSNO依赖性调控的关键位点。

3.6. Molecular dynamics calculation to assess the stability and interaction of S-nitrosothiols in CrTPI

MM-GBSA能量分解表明，Cys14-SNO的结合能稳定增益（-5.9 kcal mol^-1）高于Cys219-SNO（-2.0 kcal mol^-1），且Cys14-SNO与多个残基形成广泛相互作用网络，而Cys219-SNO仅与Lys220有较强相互作用。

3.7. Molecular basis for CrTPI regulation by S-nitrosylation

尽管Cys219远离催化中心（约20 ?），但其修饰可能通过长程变构效应影响底物结合口袋中Gly234-Gly235-Ile246模体的构象（对应人类TPI中的Gly232-Gly233-Ile243），进而干扰底物DHAP的磷酸基团稳定，导致催化效率下降。这种调控模式与人类TPI高度保守。

研究结论表明，CrTPI的GSNO依赖性调控主要通过Cys219的S-亚硝基化实现，而Cys14的修饰虽在结构上可行但并不直接参与活性抑制。该工作首次在原子分辨率下揭示了藻类TPI的氧化还原调控机制，强调了Cys219在进化中的功能保守性，为理解光合生物碳代谢的氧化还原精细调控提供了重要理论基础。此外，该发现提示TPI可能通过多种硫醇修饰方式（如S-谷胱甘化、磺酸化等）响应细胞氧化还原状态，进而整合糖酵解与碳固定代谢流，适应环境胁迫与能量需求变化。