人源低分子量鱼精蛋白（hLMWP）偶联物增强皮肤细胞渗透性与生理活性研究

本研究针对大分子或亲水性生物活性分子难以有效穿透皮肤角质层屏障的问题，开发了一种基于人源序列的低分子量鱼精蛋白（hLMWP）作为新型细胞穿膜肽（CPP）。研究人员通过将hLMWP与表皮生长因子（EGF）和超氧化物歧化酶1（SOD-1）进行偶联，证实hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1能显著提升蛋白的皮肤渗透性，并增强其促进细胞增殖、伤口愈合和抗炎等生理活性，为经皮给药和功能性化妆品开发提供了新策略。

　　

在生物医学和化妆品领域，如何让大分子或亲水性的活性成分有效穿过皮肤屏障，一直是一个重大挑战。皮肤最外层的角质层（stratum corneum）结构紧密，如同一道坚固的城墙，将许多有治疗或修复潜力的生物大分子，如蛋白质和多肽，阻挡在外。这直接限制了它们在皮肤病治疗、创伤修复和抗衰老等领域的应用效果。

为了突破这道屏障，科学家们将目光投向了一类被称为细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPPs）的特殊分子。它们能够像“特洛伊木马”一样，携带其他生物分子进入细胞内部。其中，低分子量鱼精蛋白（Low-Molecular-Weight Protamine, LMWP）因其强大的穿膜能力而备受关注。然而，传统的LMWP源自鱼类精子，存在潜在的毒性、免疫原性和副作用风险，例如可能引起低血压、血管衰竭甚至心脏骤停，这极大地限制了其临床转化和长期应用的安全性。

为了解决安全性与有效性并存的问题，来自韩国东新大学的研究团队独辟蹊径，设计并合成了一种全新的人源低分子量鱼精蛋白（human-Derived Low-Molecular-Weight Protamine, hLMWP）。其设计理念是保留LMWP的核心穿膜序列（富含精氨酸），但将其替换为源自人类蛋白质的序列（RSRRRRRRSCQTRRR），以期在保持高效穿膜能力的同时，显著降低免疫排斥反应和毒性风险，实现更好的生物相容性。

在这项发表于《Biocell》的研究中，该团队旨在系统评估这种新型hLMWP作为药物递送载体的潜力。他们重点研究了将hLMWP与两种具有重要生理功能的蛋白质——表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）和超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1, SOD-1）进行偶联后，其穿膜效率和生物活性是否得到增强。EGF是一种促进细胞生长、增殖和伤口愈合的关键蛋白，而SOD-1则是一种重要的抗氧化酶，能清除活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），保护细胞免受氧化损伤。然而，它们自身分子量大、亲水性强，皮肤渗透性极差。研究人员假设，利用hLMWP的“带路”功能，可以成功地将这些“有益”的蛋白质送入皮肤细胞，从而充分发挥其治疗潜力。

为了验证这一设想，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们采用的主要关键技术方法包括：分子克隆技术构建hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1重组质粒，利用原核表达系统（E. coli）进行蛋白表达并通过镍柱进行纯化；使用人永生化角质形成细胞（HaCaT cell）和小鼠巨噬细胞系（RAW264.7 cell）进行体外细胞实验；通过MTT法、WST-1法和BrdU法检测细胞活性和增殖；通过伤口愈合划痕实验评估细胞迁移能力；采用Griess法和ELISA（酶联免疫吸附测定）检测一氧化氮（NO）及炎症因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）水平；通过免疫荧光（IF）显微镜观察和Franz扩散池实验定量评估蛋白质的细胞及皮肤渗透性。

3.1. 表达载体的构建以及hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1的表达和纯化

研究人员成功构建了pET-41b(+)-hLMWP-EGF和pET-41b(+)-hLMWP-SOD-1重组质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。经SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析证实，纯化后的hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1分别在9.24 kDa和18.96 kDa处呈现单一条带，纯度高达95.2%和96.56%。细胞毒性试验表明，浓度高达500 ng/mL时，这两种融合蛋白对HaCaT细胞均无毒性，表明hLMWP作为载体具有良好的生物安全性。

3.2. hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1对细胞增殖的影响

通过WST-1和BrdU两种检测方法发现，hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1在所有测试浓度下（100-500 ng/mL）均能显著促进HaCaT细胞的增殖，且其效果显著优于未偶联的EGF和SOD-1蛋白。这表明hLMWP的偶联不仅没有抑制蛋白活性，反而增强了其促增殖能力。

3.3. hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1对细胞迁移的影响

伤口愈合实验结果表明，经hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1处理的细胞，其划痕区域的闭合速度显著加快。在250 ng/mL和500 ng/mL浓度下，hLMWP-EGF比普通EGF分别多减少了30.4%和27.6%的伤口距离；hLMWP-SOD-1也比普通SOD-1表现更优。此外，这两种融合蛋白还能显著提升细胞外基质重要成分——透明质酸（Hyaluronic Acid）的产量，这为它们增强伤口愈合能力提供了分子层面的解释。

3.4. hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1对炎症的抑制作用

在脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中，hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1展现出强大的抗炎活性。它们能剂量依赖性地抑制LPS诱导的一氧化氮（NO）产生。更重要的是，ELISA检测发现它们能显著降低关键促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。例如，在500 ng/mL浓度下，hLMWP-EGF对IL-1β的抑制率高达64.1%，而hLMWP-SOD-1对TNF-α的抑制率也达到52.5%，效果远超其未偶联的对应蛋白。

3.5. hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1对细胞渗透性的增强作用

这是本研究最核心的发现。通过免疫荧光染色观察发现，经hLMWP-EGF或hLMWP-SOD-1处理的HaCaT细胞内呈现出强烈的红色荧光信号（标记His标签），而未经偶联的EGF或SOD-1组信号则非常微弱。图像定量分析显示，hLMWP-EGF的细胞渗透性比普通EGF提高了32.4倍，hLMWP-SOD-1比普通SOD-1提高了6.2倍。Franz扩散池实验进一步在模拟皮肤屏障的模型上验证了这一结果，表明hLMWP-EGF和hLMWP-SOD-1的经皮渗透量分别是普通EGF和SOD-1的2.49倍和2.04倍。这两个实验共同证实了hLMWP能极大地克服皮肤屏障，高效递送生物大分子。

本研究得出结论，人源低分子量鱼精蛋白（hLMWP）是一种高效、安全的新型细胞穿膜肽（CPP）。将其与功能性蛋白质（如EGF和SOD-1）偶联后，能显著克服这些大分子药物自身的渗透性瓶颈，高效将其递送入皮肤细胞乃至穿透皮肤屏障。更重要的是，这种递送不仅没有牺牲蛋白质的原始生物活性，反而由于其更高的细胞内浓度，全方位增强了其促进细胞增殖、加速伤口愈合和缓解炎症的生理功能。

该研究的成功为经皮给药（Transdermal Drug Delivery）领域带来了新的突破。它提供了一种解决大分子药物透皮难题的普适性策略，具有巨大的转化潜力。未来，基于hLMWP的技术平台有望应用于各种难以穿透皮肤的治疗性蛋白质、肽类药物甚至核酸药物的开发中，为皮肤病治疗、再生医学（Regenerative Medicine）、医学美容（Cosmeceutical）以及功能性化妆品等领域开辟新的途径。当然，其最终的临床应用前景还需后续的动物体内实验和临床试验，对其长期安全性、免疫原性和药代动力学特性进行更深入的评估。