硫氧还蛋白F54L突变体催化中心波动加剧与蛋白不稳定性揭示神经退行及肾病新机制

本研究发现硫氧还蛋白（Thioredoxin）F54L突变通过破坏疏水相互作用网络，导致蛋白热不稳定性增强及催化中心（C32GPC35）构象波动加剧。该突变使酶在体温范围内易变性，胰岛素还原活性显著降低，分子动力学模拟显示C32-C35距离增大可能影响电子传递效率。这些分子特性为解释Txn-F54L突变大鼠出现脑退化与慢性肾病提供了关键机制依据。

　　

Highlight

蛋白质制备

将大鼠Txn基因亚克隆至pET-22b(+)质粒，添加N端8×His标签和TEV蛋白酶识别序列。转化至大肠杆菌BL21(DE3)-RILP感受态细胞，使用2-YT培养基在37°C培养至OD₆₀₀=0.8，以0.4 mM IPTG于26°C诱导过夜表达。收集细胞后经超声破碎、镍柱纯化和TEV酶切处理，最终通过凝胶过滤层析获得高纯度蛋白。

酶活性和氧化还原电位

采用胰岛素还原实验发现，rThioredoxin-F54L的还原活性显著低于野生型（p<0.01）。热稳定性分析显示突变体在体温范围（37-42°C）内更易变性，37°C孵育1小时后活性保留率仅为野生型的50%。圆二色谱证实突变体二级结构稳定性降低，氧化还原电位测定表明其电子传递效率受损。

讨论

F54L突变导致疏水核心网络瓦解，引发局部区域剧烈波动。分子动力学模拟显示突变体催化中心C32与C35间距离波动范围增加1.5?，这种构象变化可能阻碍二硫键还原反应。体温下的蛋白不稳定性导致功能性硫氧还蛋白数量减少，进而影响其调控抗氧化防御（通过过氧化物酶Prx）、DNA合成（通过核糖核苷酸还原酶RNR）和细胞凋亡通路的能力。

结论

晶体结构分析表明F54L突变未改变活性位点（C32GPC35）和S-亚硝基化位点的基本构型，但通过破坏F54与周边氨基酸（如L47、V58）的疏水相互作用，引起催化中心动态波动增强。这种分子层面的不稳定性为解释Adem大鼠出现线粒体形态异常和细胞死亡提供了结构生物学基础。

（注：原文中"Section snippets"部分包含多个子章节，此处按实际内容结构整合翻译）