综述：L-色氨酸及其衍生物的微生物生物合成进展

本综述系统总结了微生物合成L-色氨酸（L-Trp）及其高附加值衍生物的最新进展，重点探讨了代谢工程策略（如解除反馈抑制、动态调控和模块化途径优化）、关键酶工程改造以及合成生物学工具在提升产量中的应用，为构建高效微生物细胞工厂提供了重要理论依据和技术路径。

　　

L-色氨酸作为一种具有独特吲哚环结构的芳香族氨基酸，在制药和食品工业中具有广泛应用。其结构修饰后的衍生物因功能增强而备受关注。近年来，微生物合成因其环境友好特性，已成为生产L-色氨酸及其衍生物的重要方法。尽管在优化生物合成途径方面取得了显著进展，但仍存在一些关键瓶颈。

在提高L-色氨酸产量的调控策略方面，代谢工程策略发挥了核心作用。L-色氨酸的体内合成涉及多个途径，主要是Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径，并有磷酸戊糖途径（PPP）的参与。该生物合成途径与三个代谢节点相关：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、赤藓糖-4-磷酸（E4P）和分支酸（CHA）。PEP和E4P通过缩合形成3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）的前体，而CHA是L-色氨酸代谢分支中最关键的中间体。然而，固有的反馈抑制限制了下游生产的代谢通量。为提高产量，三个关键策略被证明有效：解除反馈抑制、克服前体补充限制以及消除竞争途径。

典型的反馈敏感酶包括DAHP合成酶（aroG）、邻氨基苯甲酸合成酶（trpE）和3-磷酸甘油酸脱氢酶（serA）。使用突变体如aroG^S211F、trpE^{Q71K/S94N/C465Y}和serA^H344A/N364A可使L-色氨酸的产量提高60%。除了解除反馈抑制，解决前体稀缺问题对代谢优化至关重要。通常，PEP和E4P对于芳香族氨基酸的生产是不足的。用不依赖PEP的葡萄糖摄取系统替代磷酸转移酶系统（PTS），可将L-色氨酸的产量提高至0.164 g/g葡萄糖。CHA是L-色氨酸、L-酪氨酸（L-Tyr）和L-苯丙氨酸（L-Phe）生物合成的共同前体，需要通过靶向代谢工程将碳流 specifically 导向色氨酸分支。最大化L-色氨酸生产的两个关键策略是：通过破坏L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的合成来阻断竞争途径，以及增强L-色氨酸的特定代谢通量。

利用基因编码生物传感器的动态调控为L-色氨酸生物合成提供了新的解决方案。L-色氨酸生物合成在多个水平上受到调控，但天然基因组编码的调控回路通常过于僵化。部署由可编程启动子、动态传感器和前馈或反馈环组成的模块化、可调合成遗传电路，提供了重定向和维持代谢通量的强大手段，从而显著提高了L-色氨酸及其衍生物的滴度。近年来，基于转录因子（TF）的生物传感器被广泛研究，以阐明细胞调控机制并开发新的应用。Gong等人在大肠杆菌中设计了一个基于TrpR的生物传感器。重建的TrpR1-PtrpO1系统对L-色氨酸或5-HTP表现出低基础表达和窄动态范围。TrpR1变体V58E和V58K将诱导提高了10倍。

L-色氨酸的主要衍生物可分为三大类：褪黑素相关产品、靛蓝相关产品和IAA相关产品。微生物发酵方法的快速发展为其商业化生产提供了有前景的途径。当前研究已确定大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌为优选底盘。此外，由于其真核表达系统，酿酒酵母在P450酶依赖的途径中具有独特优势。

褪黑素相关产品包括5-羟色氨酸（5-HTP）、血清素（5-HT）和褪黑素，它们源于L-色氨酸的羟基化。这些化合物共享相互连接的生物合成途径并执行相似的生物学功能。5-HTP是一种非蛋白质氨基酸，由L-色氨酸经色氨酸羟化酶（TPH）羟基化产生，是哺乳动物体内血清素和褪黑素合成的前体。5-HT是褪黑素合成中的第二个关键产品，在动物与植物中通过不同途径产生。在动物中，5-HT由5-HTP通过芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）脱羧生成。在植物中，L-色氨酸首先由色氨酸脱羧酶（TDC）脱羧生成色胺，然后由色胺5-羟化酶（T5H）羟基化。褪黑素的生物合成在动物和植物中也不同。在动物中，褪黑素合成发生在线粒体中。具体来说，5-HT被芳烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）乙酰化形成N-乙酰血清素，然后被N-乙酰血清素O-甲基转移酶（ASMT）甲基化产生褪黑素。在植物中，血清素被血清素N-乙酰转移酶（SNAT）乙酰化形成褪黑素，这一过程发生在叶绿体中。

在代谢工程进展方面，TPH作为该途径的初始酶，决定了多种下游产物的溶解度。先前的研究通过与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达以及L101和W180残基的突变，提高了其催化效率。异源表达该酶并补充辅因子也有助于提高产量。例如，整合BH₄再生途径和枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶，增强GTP生物合成和细胞内还原力，或使用BH₄类似物四氢单蝶呤（MH₄）都被证明是有效的。Zhang等人报道，在酿酒酵母中，依赖BH₄的TPH突变导致活性提高了17倍。其他研究通过共表达人TPH和BH₄途径，以及在摇瓶发酵中增强途径调控，提高了产量。此外，半理性蛋白质设计产生了具有增强热稳定性和羟基化效率的TPH突变体。

依赖磷酸吡哆醛的AADC包括色氨酸脱羧酶（TDC）、L-多巴脱羧酶（DDC）和酪氨酸脱羧酶。值得注意的是，与5-HTP相比，TDC对L-色氨酸表现出更高的催化活性和亲和力。然而，产生的副产物毒性很高。为了克服TDC对5-HTP的低亲和力以及色胺的细胞毒性，研究人员设计了一个逐步生物合成系统，将5-HTP的生产与其后续转化为5-HT在物理上分离，并实现了GSTΔ37T5H（一种特异性针对色胺的内质网膜结合细胞色素P450酶）和TDC的共表达。不幸的是，这些结果表明5-HTP和5-HT之间的转化效率仍然很差，表明涉及色胺的途径也是一个限速步骤。因此，筛选对5-HTP具有高选择性的脱羧酶至关重要。果蝇DDC（DrDDC）和异色瓢虫DDC（HaDDC）对5-HTP表现出高底物特异性。研究人员利用纯化的DrDDC合成5-HT而不产生副产物。其他研究通过在大肠杆菌中一锅表达曼氏血吸虫TPH、内源性BH₄和HaDDC，实现了414.5 mg/L的5-HT产量。

酿酒酵母中褪黑素产量低主要归因于其对酵母菌株生长的不利影响。研究人员在酿酒酵母中表达了牛AANAT，但仅获得14.50 mg/L的褪黑素。其他研究在大肠杆菌中表达了羊SNAT和水稻O-甲基转移酶（COMT），实现了高产率的褪黑素合成。后续研究通过途径优化进一步改造大肠杆菌，并通过共表达野油菜黄单胞菌的P4H以及智人的AADC和AANAT来提高产量。

靛蓝相关产品包括吲哚、靛蓝和靛玉红。吲哚是一种含氮芳香族化合物，在高浓度时散发出粪便气味，稀释后则呈现花香。它广泛用于香精和香料中。作为信号分子，吲哚调节许多生理过程，包括运动性、生物膜形成、抗生素抗性和质粒稳定性。通常，吲哚通过两条途径合成，包括吲哚-3-甘油磷酸（IGP）的逆醛醇裂解，由具有IGP裂解酶（IGL）活性的酶催化，这是L-色氨酸生物合成的关键组成部分。利用IGP作为底物的酶分为两类：色氨酸合成酶α亚基（TSA），参与初级代谢；和IGL，参与次级代谢。

大肠杆菌中过量的吲哚会抑制TnaA功能和L-色氨酸摄取。为了克服这些限制，探索了替代微生物宿主。研究人员通过表达小麦来源的TSA或IGL基因，在谷氨酸棒杆菌中实现了0.7 g/L的吲哚产量。后续研究通过共表达aroP渗透酶和雷特格变形杆菌色氨酸酶基因，以及谷氨酸棒杆菌中从葡萄糖的从头吲哚生产，将吲哚产量提高至5.7 g/L，代表了吲哚生物生产策略的重大进展。

靛蓝是一种常见的蓝色染料，具有药用价值，表现出止血、解热、抗炎和镇静特性，并已显示出潜在的抗肿瘤和抗白血病活性。靛玉红是靛蓝的3,2'-双吲哚异构体，是中药青黛和板蓝根中最丰富的活性成分，对慢性粒细胞白血病显示出显著疗效。

靛蓝和靛玉红从L-色氨酸的生物合成都经过三个阶段：L-色氨酸被色氨酸酶裂解为吲哚；吲哚被各种加氧酶氧化为吲哚酚；两分子吲哚酚在氧气存在下自发二聚形成靛蓝，而吲哚酚与2-羟基吲哚/靛红缩合则产生靛玉红。

来自 Streptomyces cattleya 的细胞色素 P450 单加氧酶 CYP102A（CYP102A_scat）和来自 Cupriavidus sp. SHE 的吲哚加氧酶 indAB 在大肠杆菌中被证明是有效的。前者是第一个能够通过吲哚羟基化合成靛蓝而无需野生型酶诱变的细菌系统，而后者在含有 1.0 g/L 色氨酸的培养基中产生了 307 mg/L 的靛蓝。环丙烷脂肪酸酰基磷脂合酶调节微生物细胞膜中环丙烷脂肪酸（CFA）的水平。其过表达增加了细胞膜中CFA的比例，降低了不饱和脂肪酸的比例，减轻了吲哚对细菌生长的细胞毒性作用。为了增加靛蓝产量，研究采用了含有靛蓝生产质粒和CFA调控质粒的重组大肠杆菌菌株。经过培养优化，靛蓝产量达到缺乏CFA质粒的对照菌株（2.7 mM）的1.5倍。先前的研究证实，靛蓝的生物合成受到NADH/NAD⁺比率重新平衡的调控。Pan等人选择苹果酸脱氢酶（mdh）作为NADH再生模块，并在大肠杆菌中组成型共表达styAB和mdh基因。在用2.0 g/L色氨酸发酵24小时后，最大靛蓝产量达到787.25 mg/L。Yin等人将黄素还原酶Fre、细胞外酶TnaA/TnaB和H₂O₂降解酶KatE引入大肠杆菌。通过补料分批发酵，补充5 mM色氨酸和10 mM 2-羟基吲哚，靛玉红产量达到250.7 mg/L。

IAA相关产品中，IAA是第一个被发现的植物生长素，是植物生长和发育的关键调节激素。此外，IAA在向光性、向重性和向水性等过程中起着至关重要的作用。除了植物，其他生物，包括细菌、酵母和丝状真菌，也能产生IAA。植物拥有四条色氨酸依赖的IAA生物合成途径：吲哚-3-乙酰胺（IAM）途径、吲哚-3-丙酮酸（IPA）途径、色胺（TAM）途径和吲哚-3-乙醛肟（IAOX）途径。其中，IPA途径是植物体内主要且进化保守的路线，而其他冗余途径并行运作。尽管不同植物物种采用独特的策略和修饰来优化其代谢途径，但由于IAA在植物生命周期中的基本作用，生长素生物合成的核心机制在进化上是保守的。

在细菌中，IAA合成途径与植物中的非常相似，除了反向的TAM途径。Romasi等人通过引入来自阴沟肠杆菌的IpdC基因（编码吲哚-3-丙酮酸脱羧酶）、来自大肠杆菌的AspC基因（编码氨基转移酶）和来自黑粉菌属的Iad1（编码吲哚-3-乙酸脱氢酶），同时删除负责色氨酸向吲哚转化的tnaA基因，对大肠杆菌进行了改造。这种方法产生了3.0 g/L的IAA。随后以10 g/L L-色氨酸为底物，通过IPA途径合成了IAA，最终在摇瓶中产生2.3 g/L IAA，在5 L生物反应器中产生7.3 g/L IAA。研究人员还使用了Rhizobium tropici CIAT 899进行IAA生物合成，并提出IPA铁氧还蛋白氧化还原酶可以合成IAA。在此基础上，Guo等人报道大肠杆菌醛脱氢酶（AldH）催化吲哚-3-乙醛氧化为IAA。在大肠杆菌MIA-6中构建的异源IAA途径实现了7.10 g/L的滴度，并且在大肠杆菌中实现了从葡萄糖从头合成IAA。

在L-色氨酸衍生的生物碱中，由色胺衍生的strictosidine衍生物被认为是最有价值的下游产品。这些生物碱的主要特征是通过吲哚重排形成的吲哚或喹啉结构。这些化合物分别被归类为吲哚生物碱或喹啉/喹诺酮生物碱。代表性的喹啉/喹诺酮生物碱包括金鸡纳树中的奎宁、奎尼丁和辛可宁，以及吴茱萸中的抗肿瘤/抗焦虑化合物吴茱萸碱。由于其复杂的结构和在植物中分布稀少，这些天然产物的进展主要集中在阐明其生物合成途径上。此外，萜类吲哚生物碱（TIA）在夹竹桃科、马钱科和茜草科植物中发现。基于长春花（Catharanthus roseus）的综合基因组和转录组数据，长春碱的生物合成途径已基本阐明。因此，为了实现这些化合物的从头生物合成，努力在酵母中实现异源生产。

Strictosidine及其重要的下游天然产物中，strictosidine是通过色胺和secologanin之间的Pictet–Spengler反应形成的。形成后，strictosidine被strictosidine β-d-葡萄糖苷酶（SGD）水解，生成一个反应性中间体，该中间体可以进一步衍生化为各种天然产物。此外，strictosidine的生物合成途径已被阐明。secologanin部分来源于香叶基焦磷酸（GPP）。GPP经过羟基化形成香叶醇，进一步羟基化生成8-羟基香叶醇。随后的步骤涉及8-羟基香叶醇氧化还原酶（GOR）和环烯醚萜合酶（ISY）产生尼泊醇内酯，然后通过一系列P450酶、糖基转移酶和甲基转移酶转化为secologanin。最后，secologanin与色胺缩合形成strictosidine。

在酵母中生产关键前体方面取得了显著进展。香叶醇、8-羟基香叶醇和尼泊醇内酯的产量分别达到1.69 g/L（1 L发酵罐）、238.9 mg/L（摇瓶）和1124.4 mg/L（摇瓶），是记录的最高浓度。然而，最初通过过表达关键酶在酿酒酵母中生产strictosidine的尝试仅产生0.5 mg/L。尽管利用了代谢工程策略和外源前体补充，strictosidine滴度已成功提高至50 mg/L，但这对于实现下游生物碱的异源生物合成仍然太低。

对于strictosidine的下游生物碱，一些生物碱如马钱子碱、阿玛碱、帽柱木碱和地波林的生物合成途径已被阐明，而奎宁和喜树碱的途径仍有待阐明。然而，由于需要多个特定的氧化还原、环化和立体选择性反应，模式生物中马钱子碱的合成尚未见报道。此外，只有在提供前体的情况下，才能实现帽柱木碱和阿玛碱的微生物生产。尽管最近的研究发现了关键的甲氧基酶CpOMT1，并发现了一条替代的非甲氧基化途径，但奎宁的不完全解析的生物合成网络继续阻碍其微生物生产。类似地，通过比较长春花和喜树（Camptotheca acuminata）的基因组，发现了strictosidinic acid，它是strictosidine的一个替代关键中间体。目前的假设提出，strictosidinic acid经过脱水和水解氧化形成pumiloside，最终转化为喜树碱。然而，完整的生物合成途径仍未解决。

长春碱是一种关键的strictosidine生物碱，其生物合成途径已完全阐明。它代表了已知最长的天然产物生物合成路线之一。具体来说，该途径在geissoschizine处与马钱子碱的途径分叉，这是由于一种特殊的geissoschizine氧化酶（GO）催化形成preakuammicine而不是dehydroakuammicine。形成dihydroprecondylcarpine acetate后，建立了两条分支：一条通过catharanthine合酶导向catharanthine，另一条通过tabersonine合酶导向tabersonine。Tabersonine然后被转化为vindoline。一旦形成，catharanthine和vindoline在III类过氧化物酶（PRX1）的催化下偶联产生长春碱。

酵母宿主（酿酒酵母和毕赤酵母）是长春碱生物合成的首选，因为它们具有真核蛋白表达系统。尽管酿酒酵母已被改造用于生产catharanthine和vindoline前体，但随后PRX1的表达表明无法获得该酶的正确转录后加工。因此，通过Fe(III)化学偶联微生物生产的前体，得到长春碱（23.9 μg/L）。此外，非常规酵母毕赤酵母实现了2.57 mg/L catharanthine的从头合成。

为了管理长路径，基于易于检测的代谢中间体进行划分已被证明可有效降低工程复杂性。这种模块化的概念先前在另一种长路径化合物东莨菪碱的微生物合成中得到证实。例如，catharanthine途径被划分为不同的模块：CAN模块（将香叶醇转化为尼泊醇内酯）、STR模块（将尼泊醇内酯转化为strictosidine）和NPT模块（将strictosidine转化为catharanthine）。这种模块化方法促进了catharanthine途径的构建。此外，这项工作采用了一种反向工程策略，从目标终产物开始，通过外源补充途径中间体来组装完整途径。

酶步骤效率的显著差异需要通过识别瓶颈来优化产量。这可以通过结合中间体浓度的量化以及精确定位那些喂食外源前体导致产物产量可检测增加的步骤来实现。通过这种方法，catharanthine途径的瓶颈通过将基因拷贝数增加与滴度变化相关联而创新性地识别出来。

此外，当前构建生产长春碱的微生物细胞工厂的策略主要集中在增强strictosidine生物合成和优化下游途径酶。通过代谢工程和关键酶诱变提高了strictosidine产量，以及通过努力优化下游酶。虽然strictosidine合成已经很成熟，但下游植物来源的酶带来了持续的挑战。例如，定位于细胞核的CroSGD在植物中形成功能性复合物，但在酵母中表现出细胞质错误定位和完全丧失催化活性，即使经过截断尝试。类似地，CroPRX1即使在尝试C端或N端截断后也未能表现出催化活性。这些失败例证了异源酶功能性的核心障碍。因此，工业规模生产需要解决多酶协调、植物酶兼容性以及管理细胞毒性中间体的问题。

结论与展望部分指出，几十年来，通过利用合成生物学的新策略对工程底盘进行改造，L-色氨酸及其衍生物的微生物合成迅速发展。与随机诱变菌株相比，L-色氨酸的微生物细胞工厂更适合工业生产和衍生物的代谢工程。然而，由于大多数衍生物的滴度较差，需要进一步研究以提高转化效率。例如，5-HT和溴化L-色氨酸等主要衍生物的最高报道滴度仍处于毫克水平，而在相同发酵条件下L-色氨酸的产量达到50 g/L。L-色氨酸与其衍生物之间的这种不对称性突出了前体在足够代谢通量下的工程潜力。

体内L-色氨酸途径的抑制解除代谢调控已被识别，但L-色氨酸衍生物引起的生长抑制机制仍不清楚。尽管适应性进化已被应用于提高耐受性，但进化菌株的表型稳定性对于工业应用仍不能令人满意。因此，用于代谢物的基因组规模模型可用于在这些情况下精确优化表达。通过全局分析识别靶基因，特别是那些与L-色氨酸代谢不相关的基因，将更为有效。此外，大多数相关研究是在细菌中进行的，因为这些底盘中的L-色氨酸途径代谢通量丰富。然而，一些衍生物的下游途径涉及复杂的酶促反应，更适合酿酒酵母等真核底盘。如前所述，L-色氨酸衍生的生物碱的微生物合成主要在酵母中进行测试。因此，构建用于L-色氨酸或色胺的高滴度酵母平台对于这些衍生物的微生物细胞工厂将是不可或缺的。

特别是，其他生物碱的天然生物合成途径仍然低效或尚未在微生物中实现。为了解决这一瓶颈，通过比较转录组学在植物中挖掘未表征的酶是基本的工作流程。尽管有限的转录组使这项工作更具挑战性，但下一代测序技术和机器学习模型的进步有望加速酶的发现。总之，微生物细胞工厂很快将成为生产L-色氨酸复杂衍生物的实用程序，利用合成生物学与人工智能的结合。