连接蛋白43通过WNK1-c-MYC信号轴驱动胶质母细胞瘤癌症干细胞表型

本刊推荐：为解决胶质母细胞瘤(GBM)中连接蛋白43(Cx43)功能争议问题，研究人员开展Cx43-WNK1-MYC信号轴研究，发现Cx43通过调控WNK激酶1(WNK1)维持c-MYC表达，驱动GBM癌症干细胞(CSC)的生存、自我更新和肿瘤发生，为靶向CSC提供新策略。

　　

胶质母细胞瘤是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，患者确诊后的中位生存期通常不足两年。尽管采用手术切除联合放疗和替莫唑胺化疗的标准治疗方案，肿瘤仍然不可避免地复发。治疗抵抗和复发与肿瘤内在特性密切相关，其中具有自我更新能力的癌症干细胞(CSC)被认为是治疗抵抗和肿瘤再生的关键驱动因素。此外，肿瘤细胞与微环境间的相互作用也参与这一过程。因此，靶向这些肿瘤支持特性将成为未来治疗开发的重要方向。

在正常组织中，相邻细胞通过直接通信协调复杂过程，并通过多种方式感知和响应周围微环境。间隙连接细胞间通信(GJIC)是其中一种重要方式，由连接蛋白(connexin)构成的间隙连接介导。六个连接蛋白分子形成六聚体结构，称为连接子(connexon)或半通道(hemichannel)，其中心孔道开放允许小分子通过。一个细胞膜上的连接子与相邻细胞膜上的连接子对接，形成完整的间隙连接，允许代谢物、离子、微小RNA和小于1kD的蛋白质在细胞间转移。在某些情况下，连接子也能作为半通道独立发挥作用，实现细胞与细胞外空间的小分子交换。连接蛋白还能通过其C端胞质尾部与多种细胞内蛋白质相互作用，作为支架蛋白连接其他分子。人类有21种连接蛋白，其主要序列差异体现在C端尾部。这种多样性使得特异性靶向连接蛋白具有挑战性。

连接蛋白和间隙连接传统上被认为具有肿瘤抑制作用，基于在肿瘤组织(包括GBM)中经常观察到GJIC减少和连接蛋白表达缺失。然而，最近研究表明某些癌症类型依赖特定连接蛋白的表达，既通过间隙连接依赖的方式，也通过间隙连接非依赖的方式。特别是在胶质母细胞瘤中，患者来源异种移植(PDX)模型的癌症干细胞依赖连接蛋白46(Cx46)的细胞间通信，而三阴性乳腺癌干细胞则依赖Cx26与NANOG和黏着斑激酶(FAK)形成的细胞内复合物。在这两种情况下，靶向连接蛋白都能抑制肿瘤生长和干细胞自我更新。尽管在体内特异性靶向连接蛋白仍面临挑战，但通过抑制连接蛋白功能或阻断其下游事件可能带来治疗获益。

研究最广泛且频繁研究的连接蛋白Cx43在包括GBM在内的多种癌症中既被报道具有促瘤作用，也被报道具有抑瘤作用。GBM患者样本和肿瘤细胞系中Cx43表达水平差异很大，且通常(但非绝对)低于正常脑组织水平。功能上，GBM中的Cx43表达被证明可驱动诸如治疗抵抗、细胞增殖和存活以及肿瘤细胞侵袭和迁移等促肿瘤特性。然而，也有相反的研究结果表明，将Cx43引入GBM细胞系可减少增殖和迁移。许多关于Cx43在GBM中的研究受限于使用传统的血清培养细胞系(人或大鼠)，这些细胞系不能重现患者肿瘤中观察到的复杂细胞异质性和分子改变。在GBM的CSC模型中进行的研究较少，但同样产生了矛盾的结果；特别是，Cx43可通过抑制SRC信号抑制肿瘤生长，也可通过激活PI3K/AKT促进对替莫唑胺的化疗抵抗。

本研究旨在探究Cx43在GBM癌症干细胞中的表达、功能及作用机制。研究人员通过RNA测序分析发现Cx43在多个GBM PDX CSC模型中高表达，并通过免疫组化证实其在患者肿瘤组织中存在可变表达且主要定位于细胞内。功能实验表明，敲低Cx43显著抑制CSC的增殖、存活、自我更新和肿瘤形成能力。机制上，Cx43通过调控WNK激酶1(WNK1)的表达维持原癌基因c-MYC的转录水平，从而驱动CSC的恶性表型。进一步研究发现WNK1敲低可模拟Cx43缺失的表型，抑制c-MYC表达和肿瘤发生。该研究揭示了一条Cx43-WNK1-MYC信号轴在GBM CSC中的关键作用，为靶向CSC提供了新的潜在靶点。

研究人员为开展本研究应用了几项关键技术：利用患者来源异种移植(PDX)癌症干细胞模型进行体外功能实验；通过RNA干扰(shRNA)技术敲低Cx43和WNK1表达；采用免疫印迹、免疫荧光和ELISA检测蛋白表达和定位；通过细胞活力检测、凋亡分析和极限稀释实验评估细胞表型；利用RNA测序进行转录组分析和基因集富集分析；使用体内肿瘤形成实验评估体内肿瘤发生能力。

Cx43在GBM PDX CSC中表达

研究人员首先通过RNA测序分析三个GBM PDX CSC模型(T4121、T3691和DI318)中所有连接蛋白基因的表达，发现Cx43(GJA1)mRNA表达水平相对高于其他连接蛋白。通过免疫组化检测GBM患者组织中的Cx43蛋白表达，发现其表达强度在不同患者间存在差异(从强到弱/可忽略)，且主要形成松散的点状凝聚，与心脏组织中的典型间隙连接斑块不同。在多个GBM PDX CSC系中通过免疫印迹检测到Cx43蛋白表达，水平介于正常人类星形胶质细胞(高表达)和非GBM癌细胞系(低表达)之间。细胞定位分析显示Cx43主要位于细胞内近核区室(可能为高尔基体或内质网)，少量存在于质膜上。

Cx43对GBM CSC存活和自我更新至关重要

在多个PDX CSC模型中使用三种不重叠的shRNA构建体敲低Cx43 mRNA后，观察到细胞数量显著减少，并伴随 caspase 3/7活性增加的凋亡细胞死亡。极限稀释分析显示干细胞频率显著降低。颅内植入表达Cx43 shRNA的DI318 CSC后，显著延长了NSG小鼠的生存期。这些结果表明Cx43是GBM CSC特性(包括存活、自我更新和肿瘤发生)所必需的。

Cx43调控c-MYC原癌基因表达

对表达Cx43 shRNA的细胞进行RNA测序发现，与表达非靶向shRNA的细胞相比，原癌基因c-MYC水平降低。两种shRNA的结果均显示，下调最显著的基因集包括c-MYC靶基因。qRT-PCR和免疫印迹验证了Cx43敲低后c-MYC mRNA和蛋白水平的降低。通过癌症依赖图谱(DepMap)门户分析发现，与c-MYC具有共依赖关系的基因包括MAX、MIOS、HSD17B10和WNK1。选择WNK1作为候选介导Cx43和c-MYC间信号的中间分子，发现Cx43 shRNA降低WNK1水平。

WNK1是GBM CSC存活和自我更新所必需的

使用三种不重叠的shRNA构建体降低WNK1水平后，细胞数量减少，凋亡增加，自我更新能力显著降低。颅内植入表达WNK1 shRNA的CSC后，小鼠生存期显著延长，表明WNK1驱动肿瘤细胞生长和肿瘤发生。

WNK1调控GBM CSC中的c-MYC表达

WNK1敲低细胞的RNA测序显示c-MYC和c-MYC靶标显著下调。qRT-PCR证实WNK1 shRNA降低c-MYC mRNA水平，免疫印迹显示c-MYC蛋白减少，报告基因实验表明其活性降低。其他WNK家族成员(WNK2、WNK3、WNK4)mRNA表达水平低且不随Cx43或WNK1敲低而增加，表明其他WNK蛋白至少在转录水平不补偿Cx43或WNK1的缺失。

本研究揭示了Cx43通过WNK1调控c-MYC表达在GBM CSC中的关键作用。尽管连接蛋白传统上被认为具有肿瘤抑制作用，但本研究发现在GBM CSC中Cx43主要位于细胞内，通过非连接功能维持c-MYC表达和CSC特性。机制上，Cx43缺失导致WNK1水平降低，进而减少c-MYC转录，最终抑制CSC的增殖、存活、自我更新和肿瘤发生。该研究不仅解决了Cx43在GBM中功能争议的问题，还发现了一条新的Cx43-WNK1-MYC信号轴，为开发靶向CSC的治疗策略提供了新靶点。此外，研究还提示靶向难以成药的蛋白(如Cx43、WNK1和c-MYC)周围信号节点可能提供更可行的治疗策略。

研究的局限性包括仅深入研究了三个PDX GBM模型，未来需要更多模型验证；性别差异可能影响GBM细胞表型，需更多性别平衡模型验证；Cx43具体通过哪种功能(GJIC、半通道或蛋白互作)启动信号网络尚不清楚；WNK1激酶活性在表型中的作用有待阐明。未来研究应着重解决这些问题，并探索该信号轴是否可由其他连接蛋白启动。