COVID-19大流行期间携带blaNDM-1和/或blaKPC-2的ST346碳青霉烯类耐药华西普罗威登斯菌的传播动态演变与分子机制研究

本研究针对碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌（CRPs）引起的治疗难题，通过十年前瞻性监测，揭示了医院获得性高毒力ST346克隆（华西普罗威登斯菌）在COVID-19大流行期间通过可移动遗传元件（MGEs）介导blaNDM-1和blaKPC-2传播的动力学机制。研究发现ST346-Cluster I取代Cluster III成为主导传播克隆，且贝叶斯天际线分析显示其种群规模在2020-2022年间扩张120%，凸显了医院环境作为耐药基因扩散温床的严峻形势。该研究为院内感染防控提供了关键分子流行病学依据。

　　

在微生物耐药性全球蔓延的背景下，碳青霉烯类抗生素作为治疗严重细菌感染的"最后防线"正面临严峻挑战。普罗威登斯菌属（Providencia spp.）作为机会性病原体，可引起尿路感染、肺炎、败血症和脑膜炎等多种严重感染。尤其令人担忧的是，碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌（CRPs）的出现和传播，特别是那些携带新德里金属β-内酰胺酶（bla_NDM）和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（bla_KPC）的菌株，已经成为全球公共卫生的重要威胁。

尽管此前已有一些关于CRPs的个案报道，但大多数研究缺乏系统的分子流行病学分析和传播动力学研究。特别是在COVID-19大流行期间，感染控制措施的改变和消毒剂的广泛使用可能对医院内微生物种群动态产生了深远影响，这一领域的深入研究仍然缺乏。

为了解决这些科学问题，浙江大学的姚佳瑶、何锦涛、郭静仪等研究人员在《iScience》杂志上发表了一项重要研究，通过长达十年的前瞻性监测，系统分析了携带bla_NDM-1和/或bla_KPC-2的碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌的传播动态和分子机制。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：收集2017-2024年间临床和环境样本进行菌株分离；通过全基因组测序（WGS）和平均核苷酸一致性（ANI）分析进行物种鉴定；采用多位点序列分型（MLST）分析菌株遗传背景；通过接合转移实验评估质粒传播能力；使用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫模型评估菌株毒力；应用贝叶斯天际线分析研究种群动态演变；利用生物信息学工具分析移动遗传元件（MGEs）和耐药基因环境。样本来源包括浙江省人民医院住院患者和医院环境（病房水槽、厕所和医疗废水）。

临床碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌的特征

研究共收集到151株产碳青霉烯酶的CRPs分离株。通过全基因组测序和ANI分析，40株临床来源的CRPs被鉴定为三个已知物种：华西普罗威登斯菌（P. huaxiensis，n=27）、杭州普罗威登斯菌（P. hangzhouensis，n=8）和雷特格普罗威登斯菌（P. rettgeri，n=5）。这些分离株主要来自尿液样本（70.0%），其中53.5%显示临床感染证据。值得注意的是，92.5%的采样部位有侵入性导管干预史。此外，还从临床环境（病房水槽和厕所）和医疗废水中分离到6株携带bla_NDM-1的CR-P. huaxiensis，使总研究菌株数达到46株。

抗菌药物敏感性

所有46株CRPs均表现出对临床重要抗菌药物的多重耐药性（MDR）。它们对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢吡肟、环丙沙星、头孢他啶和头孢他啶-阿维巴坦均显示100%耐药率。对阿米卡星、氯霉素和氨曲南的耐药率分别为93.48%、93.48%和17.39%。值得注意的是，头孢地尔（cefiderocol，MIC₉₀≤2 mg/L）和氨曲南-阿维巴坦（MIC₁₀₀≤0.06 mg/L）表现出强大的抗菌活性。所有分离株还对消毒剂氯己定表现出耐药性（MIC₇₅≥64 mg/L）。

46株碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌的遗传特征

所有分离株均携带bla_NDM-1，其中9株CR-P. huaxiensis同时携带bla_NDM-1和bla_KPC-2。通过PubMLST分析，CR-P. huaxiensis的主要序列型（ST）为ST346（93.9%，31/33），其他发现的ST包括ST4（n=1）和ST142（n=1）。CR-P. hangzhouensis中鉴定出ST44（n=5）和ST32（n=3）。所有5株CR-P. rettgeri被暂时归类为ST221。这些分离株表现出多重耐药表型，携带超过14类抗菌药物耐药基因。值得注意的是，消毒剂耐药基因（qacE△1-su/1）普遍存在（95.7%的分离株中检测到）。

携带bla_NDM-1的质粒遗传特征

除WW-Pro-2的bla_NDM-1位于染色体外，其余45个携带bla_NDM-1的质粒被分为四组：IncT_NDM-repM（n=21）、pCTX-M_NDM-repM（n=16）、pZ32CR2270_NDM-like（n=6）和pZ24CR2199_NDM-like（n=2）。BLAST分析表明这些质粒主要涉及摩根菌科（Morganellaceae）内的种间传播，包括摩根摩根菌（Morganella morganii）、普罗威登斯菌属和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）。IncT_NDM-repM和pCTX-M_NDM-repM质粒均包含一个相同的携带bla_NDM-1的插入序列（约36-kbp），两侧为Tn3家族和Tn5073-like（merRTPFA-DE_urf2）元件。序列比对显示这个36-kbp元件精确整合：在IncT中无缝插入hp基因位点（GATACATAGACAGTAAGATG），在pCTX-M中插入tral基因位点（GTTATCGCGGCATTTAACCA），且缺乏典型的靶位点重复（TSDs）。

bla_NDM-1的遗传环境分为两种类型的Tn125衍生物（△Tn125-1和△Tn125-2）。△Tn125-1元件在两个不同的质粒组（IncT_NDM-repM和pCTX-M_NDM-repM）中被鉴定出来，呈现一个转座子结构，包含bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-dsbD-cutA-groEL-ISCR21-hp-IS26，只有一个ISAba125拷贝。在pZ2CR1897_NDM-1中发现了两个IS26-ISAba125-bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-dsbD-groES-groEL-ISCR21-hp-IS26序列拷贝。△Tn125-2在p24CR2199_NDM-like质粒、pZ32CR2270_NDM-like质粒和WW-Pro-2染色体中被鉴定出来。

双碳青霉烯酶产ST346分离株的遗传特征

9株双碳青霉烯酶产生（DCP）ST346 CR-P. huaxiensis同时携带IncT_NDM-repM质粒和其他四种bla_KPC-2携带质粒类型：pZ26CR2253_KPC-like（n=4）、pZ21CR2119_KPC-like（n=2）、pZ38CR2433_KPC-like（n=2）和IncP（n=1）。BLAST分析表明这些质粒跨越至少六个细菌属，涉及多个分类科：柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）和克雷伯菌属（Klebsiella）（肠杆菌科）；奇异变形杆菌（摩根菌科）；和铜绿假单胞菌（假单胞菌科）。此外，在bla_KPC-2的遗传环境中鉴定出四种Tn6296衍生的变体（△Tn6296-1至△Tn6296-4）， characterized by insertions and deletions。值得注意的是，△Tn6296-4存在于pZ21CR2119_KPC-like质粒中，显示了五个由IS26侧接的AtnpR-ISKpn27-bla_KPC-2拷贝。

质粒转移能力和适应性代价

在四种携带bla_NDM-1的质粒中，只有IncT_NDM-repM型质粒（85.7%，18/21）能够接合转移至受体菌E. coli J53，接合效率高达5.04E-2（IQR：2.50E-2，9.17E-2），并且具有长期稳定性（70代后保留率>95%）。此外，携带IncT_NDM-repM的接合子与受体菌E. coli J53相比生长显著受损，包括OD₆₀₀降低（F=12.78，p<0.0001）、AUC减少（F=184.1，p<0.0001）和相对生长速率降低（约17.31%-19.41%，p<0.0001）。除了IncP质粒外，其他三种质粒（pZ21CR2119_KPC_like、pZ26CR2253_KPC_like和pZ38CR2433_KPC_like）也能转移至E. coli J53，接合效率分别为2.32E-2、6.39E-5和6.89E-3。两种类型的bla_KPC-2携带质粒在接合子中也表现出适应性代价。

碳青霉烯类耐药普罗威登斯菌的系统发育分析

为了阐明CRPs的进化关系，研究人员使用Snippy基于46株菌（包括三个物种）的核心基因组分析了SNP差异。值得注意的是，30株ST346 CR-P. huaxiensis分离株显示SNP≤135，除了三株分离株（Z5CR1824、WW-Pro-1和WW-Pro-2）。这些菌株聚集成三个不同的簇（Cluster I-III）：Cluster I（n=12）统一携带pCTX-M_NDM-repM质粒，SNP范围1-36。在该簇内，4株环境分离株（WJS-Pro-1至WJS-Pro-4）和3株患者来源分离株（Z25CR2199、Z19CR2107、Z23CR2179）显示<25 SNP，暗示患者-环境克隆传播的证据。另外两个克隆均携带IncT_NDM-repM质粒，包括Cluster II（n=3，SNP<20）和Cluster III（n=13，SNP<25）。相比之下，CR-P. hangzhouensis和CR-P. rettgeri在本研究中未显示克隆传播。

结合SNP和时间线的传播动力学分析表明，Cluster III和Cluster I分别在2018年和2020-2022年经历了克隆传播事件，其中Cluster III在2024年出现复发迹象。

ST346 CR-P. huaxiensis分离株的毒力

使用大蜡螟幼虫感染模型评估了ST346 CR-P. huaxiensis分离株的毒力水平。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，ST346-Cluster I和ST346-Cluster III在大蜡螟模型中均表现出显著毒力。值得注意的是，ST346-Cluster I与高毒力肺炎克雷伯菌菌株NTUH-2044相比显示出显著更高的毒力（p<0.0001，HR=1.949），而ST346-Cluster III与NTUH-2044毒力相当（p=0.6427）。此外，ST44和ST346-Cluster III之间的毒力无统计学显著差异（p=0.6427）。相比之下，ST32与低毒力肺炎克雷伯菌菌株XH1508相比毒力无显著差异（p=0.7162）。

全球华西普罗威登斯菌的流行病学分析和系统发育分析

从NCBI数据库检索到1,697个非冗余的普罗威登斯菌全基因组序列，地理元数据分析显示菌株主要来源为中国（41.9%，n=712）和美国（30.0%，n=510）。91.4%的分离株（1551/1697）使用FastANI（ANI>95%）被分类为14个已知物种，其中大多数为斯图亚特普罗威登斯菌（P. stuartii，22.9%，388/1697），其次是杭州普罗威登斯菌（21.7%）、雷特格普罗威登斯菌（17.1%）、华山普罗威登斯菌（14.6%）、氧化锰普罗威登斯菌（4.2%）、华西普罗威登斯菌（3.3%）和产碱普罗威登斯菌（2.7%）。

值得注意的是，华西普罗威登斯菌的低全球流行率与在本医院的临床主导地位之间存在矛盾差异；相反，全球流行的斯图亚特普罗威登斯菌在长达十年的CRPs流行病学调查中未被检测到。此外，杭州普罗威登斯菌主要在中国发现（65.3%，241/369），而华山普罗威登斯菌更 prevalent 于美国（55.4%，137/247）和中国（24.6%，61/247）。这些矛盾可能表明某些物种的流行病学特征尚未被充分探索，例如增强的宿主适应性或区域传播优势。

为了进一步阐明华西普罗威登斯菌的传播动力学和进化关系，研究人员对89株菌（33株来自本研究，56株来自NCBI）进行了核心基因组系统发育分析。这些菌株主要来源于中国（n=76），美国（n=7）、加拿大（n=4）和法国（n=1）的代表有限。使用PubMLST方案，82株分离株（92.1%，82/89）被分类为16个ST。两个主导克隆ST346（n=33）和ST4（n=16）表现出局部暴发模式， exclusively 在中国流通，同时显示出相反的 temporal 流行趋势。值得注意的是，ST346局限于浙江省，仅从人类和环境来源分离，而ST4展示了更广泛的地理分布，跨越中国八个省份，涵盖人类、动物和环境 reservoir。此外，在ST200和ST252中观察到人畜共患潜力，而其他十二个ST显示宿主限制模式，仅限于人类或动物宿主。

最大似然系统发育分析将所有基因组分为三个主要分支（Clade I-III）。Clade I（n=49）是最大的簇，以ST346克隆（n=33）为主，碳青霉烯耐药率（CRR）为100%，与bla_NDM（n=33）和bla_KPC（n=11）相关，而ST4克隆（n=16）的CRR仅为56.25%（9/16），与bla_NDM（n=6）、bla_IMP（n=1）和bla_VIM（n=1）相关。Clade II（n=19）包含六个ST和五个未分型分离株，显示78.95%（15/19）的CRR，与bla_IMP（n=8）和bla_NDM（n=7）相关。Clade III（n=16）由四个ST和八个未分型分离株组成， demonstrate 81.25%（13/16）的耐药率，与bla_NDM（n=10）和bla_IMP（n=3）相关。具体而言，11株ST346分离株（33.3%，11/33）被鉴定为同时产KPC和NDM酶的CRPs。

ST4和ST346克隆菌株的起源和迁移动力学

使用非相关松弛时钟（5亿次迭代）对15株ST4分离株进行的贝叶斯天际线分析估计分化时间约为1929.79（ESS>2000），进化速率为3.08E-3（ESS>1000），区域迁移率为1.86E-2（ESS>2000），宿主相关迁移率为1.02E-2（ESS>2000）。对于ST346克隆分离株，使用严格时钟（2亿次迭代）对33株分离株估计分化时间为2008.37（ESS=736），进化速率为1.72E-2（ESS=534）。

使用贝叶斯天际线分析克隆群体的动态进化以估计有效种群大小（Ne）。对于ST4克隆分离株，Ne在整个研究期间保持在1,000以下，而该谱系在2021年后经历了约80%的收缩。相比之下，ST346克隆分离株表现出相对较小的Ne值（<100），表明可能存在医院级别的流行。值得注意的是，该谱系发生了快速扩张，中位Ne在2019-2021年间几乎翻倍（约120%的增长）。2021年后，ST346克隆分离株的Ne观察到约50%的收缩。

贝叶斯时间分化和系统地理学建模（SpreadD3）的联合分析估计了1942年至2024年间中国ST4华西普罗威登斯菌克隆分离株的异质空间传播网络。关键传播枢纽包括四川（后验概率峰值：0.21）、广东（峰值：0.12）、北京（峰值：0.17）和安徽（峰值：0.16）。宿主的后验概率估计智人（峰值：0.75）和苍蝇（峰值：0.25）是传播的关键。四川作为ST4克隆分离株的起源，通过人类介导的传播依次将菌株传播至安徽（1942-1960）和北京（1958-1972）。随后，安徽通过昆虫载体（苍蝇）进一步将克隆传播至广东（1962-1991）。值得注意的是，广东成为主要传播枢纽，通过 diverse 传播途径将克隆菌株引导至浙江（1992-2020）、河南（1992-2020）和陕西（2008-2024）。

讨论

本研究通过十年监测，揭示了医院获得性高毒力ST346 CR-P. huaxiensis克隆的出现和传播，该克隆携带bla_NDM-1和/或bla_KPC-2，并通过移动遗传元件（MGEs）促进这些耐药基因的 mobilization。研究结果强调了临床环境作为耐药基因传播温床的重要性，特别是在COVID-19大流行期间。

研究发现ST346-Cluster I（携带不可转移的pCTX-M_NDM-repM质粒）取代了ST346-Cluster III（同时携带IncT_NDM-repM和pCTX-M质粒）。这种转变可能发生的原因是Cluster I从Cluster III谱系进化而来，通过将36-kbp NDM-repM片段从IncT整合到pCTX-M中，随后丢失了IncT质粒。这种基因组精简可能减少了适应性代价，从而增强了其驱动医院传播的能力。值得注意的是，Z25CR2199分离株与四个临床环境分离株之间的最小SNP差异（<10 SNP）阐明了"临床环境到患者"的传播链。这种环境微生物筛查表明，水槽盆地和厕所座是医院病原体传播的重要 reservoir，为优化临床感染控制方案提供了可操作的见解。

IncT_NDM-repM和pCTX-M_NDM-repM质粒均携带一个相同的约36-kbp插入序列，该序列携带bla_NDM-1，两侧为Tn3家族和Tn5073-like汞抗性模块（merRTPFA-DE_urf2），位于hp和tral上，这是一种非典型重组机制， characterized by the absence of TSDs。Tn3家族转座子在ARGs传播中广泛存在且 notorious，特别是碳青霉烯耐药的流行。此外，IncT_NDM-repM质粒表现出高转移效率（5.04E-2，IQR：2.5E-2，9.17E-2）和长期稳定性（70代后保留率>95%），促进了质粒介导的种间ARGs传播。

NCBI数据库揭示了一个矛盾的流行病学模式：华西普罗威登斯菌表现出低全球流行率但在本医院内高临床地方性流行，而 typically 主导的斯图亚特普罗威登斯菌在本地普罗威登斯菌种中缺失。这种差异可能反映了未被充分认识的流行病学特征（例如，宿主适应性）和/或抗菌药物过度使用驱动的区域传播网络，这些网络促进了华西普罗威登斯菌和隐秘物种（如杭州普罗威登斯菌）的生态位 dominance。

通过贝叶斯天际线分析，研究人员观察到COVID-19大流行期间ST4和ST346华西普罗威登斯菌克隆的一个有趣现象。一直处于缓慢下降状态的ST4克隆在大流行期间种群规模急剧下降（约80%）。相比之下，ST346克隆在2019年至2021年间发生了短期暴发（约120%的增长），然后在2022年至2024年间快速收缩。研究人员分析了潜在驱动因素：首先，大流行期间消毒剂的广泛使用可能加剧了ST4的收缩（MIC_CHG=16），其耐药性 profile 与ST346相比更弱（MIC_CHG中位数=64）。第二，主要依赖社区和多宿主传播途径的ST4克隆可能由于COVID-19大流行期间实施的社会距离和感染控制措施而经历了传播中断。相比之下，ST346克隆携带多个耐药决定簇，包括 universal 碳青霉烯耐药率100%和qacE△1-su/1消毒剂耐药盒（95.7%流行率），使其能够在 confined 生态位中的选择压力下进行短期克隆扩张。生长曲线测定表明质粒携带存在适度的适应性代价，这可能是ST346克隆在后期经历适应性不稳定和种群下降的原因之一。

结论

这项长达十年的监测研究通过全面的表型-基因型分析描绘了bla_NDM-1和bla_KPC-2在CRPs中的传播动力学，证明临床环境与"One Health"框架内的克隆传播和医院暴发显著相关。值得注意的是，研究人员报告了ST346华西普罗威登斯菌中的DCP菌株，并追踪了它们进化获得NDM和KPC产生能力的过程。传播动力学分析发现Cluster III被Cluster I取代以减少适应性代价，从而增强了其在COVID-19大流行期间（2020-2022）驱动医院传播的能力。此外，还鉴定出IS26介导的质粒中bla_NDM-1和bla_KPC-2的插入和扩增，以及ISCR1驱动的滚环复制，在染色体上形成三个bla_NDM-1拷贝。研究结果还强调了全球传播克隆与区域限制菌株之间的 divergent 进化轨迹。最后，贝叶斯天际线分析显示ST346和ST4克隆群体在COVID-19大流行期间表现出相反的种群扩张模式。因此，医院克隆传播的多维监测势在必行，特别是在伴有严重感染的情况下。