靶向染色质编辑揭示模拟表观遗传记忆：DNA甲基化梯度调控基因表达水平的长时程维持

本研究针对表观遗传记忆是否仅支持二元状态的局限，通过构建基因组报告系统和靶向表观效应器，结合数学模型与单细胞追踪，首次证实染色质修饰可维持基因表达的连续梯度状态（模拟记忆），并揭示DNA甲基化（DNAme）梯度是记忆维持的核心介质，而H3K9me3仅作为中间调控因子。该发现突破了传统二元记忆模型，为哺乳动物细胞工程和发育调控提供了新范式。

　　

在细胞命运决定、免疫记忆形成和神经系统功能中，表观遗传记忆扮演着核心角色。它使细胞在DNA序列不变的情况下，将基因表达状态稳定传递至子代细胞。传统理论认为，这种记忆是“二元”的：基因要么完全开启（active），要么完全沉默（silenced），就像电灯开关一样非开即关。这种二元性常归因于组蛋白修饰（如H3K9me3和H3K4me3）的自催化反馈环路，它们能自我强化并抵抗状态改变。然而，生命过程是否如此绝对？基因表达能否像调光开关一样，稳定维持在从低到高的任意水平？即是否存在一种“模拟”的表观遗传记忆？这个问题长期悬而未决，因为缺乏能在天然染色体背景下、以单细胞分辨率精准扰动并长期追踪染色质状态和基因表达的工具。

此前研究多基于人工染色体或特定内源基因位点，其结论的普适性存疑。染色质修饰的效应高度依赖于遗传背景，因此，在更接近生理状态的天然染色体环境中，系统性地探索表观遗传记忆的潜能，对于理解细胞身份维持、疾病发生乃至开发新型细胞治疗策略都至关重要。

为了回答这一根本问题，研究人员在《Cell Genomics》上发表了他们的最新成果。他们独辟蹊径，成功构建了一个整合于哺乳动物细胞内源基因位点（ROSA26 locus）的单拷贝报告基因系统。该系统包含一个由EF1α启动子驱动表达的荧光蛋白报告基因（EBFP2），其两侧 flanked 了绝缘子序列以隔绝周边基因的干扰，上游还设计了用于招募表观编辑器的结合位点（如dCas9、rTetR、PhlF的靶位点）。借助这一精密的“基因雷达”，他们开发了一套靶向编辑染色质状态的融合蛋白工具（如DNMT3A-dCas9用于添加DNA甲基化；rTetR-KRAB用于添加H3K9me3；rTetR-TET1用于去除DNA甲基化），并通过瞬时转染和流式细胞分选技术，实现了对特定染色质状态的精准设定和不同表达水平细胞群体的分离与长期追踪。结合甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）、靶向亚硫酸氢盐测序等分子生物学技术，以及一个创新性的、同时包含组蛋白修饰和DNA甲基化的染色质修饰数学模型，他们深入探究了表观遗传记忆的运作机制。

关键实验技术方法概览

研究主要应用了以下关键技术：1) 位点特异性染色体整合技术，将单拷贝报告基因精准插入CHO-K1细胞的ROSA26位点；2) 模块化表观效应器构建技术，将DNMT3A、TET1、KRAB等催化结构域与dCas9、rTetR等DNA结合域融合，实现靶向编辑；3) 高时间分辨率流式细胞术与荧光活化细胞分选（FACS），用于在单细胞水平长期追踪基因表达动态并分选特定群体；4) 甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP-qPCR）和染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR），定量检测特定基因组区域的DNA甲基化和组蛋白修饰水平；5) 靶向亚硫酸氢盐测序，在单碱基分辨率上测定报告基因区域的DNA甲基化状态；6) 基于Gillespie算法的随机模拟，构建并验证了整合DNA甲基化与组蛋白修饰的数学模型。

An engineered genomic reporter system to study gene expression dynamics post targeted chromatin editing

研究人员首先成功构建了上述基因组报告系统，并通过实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）证实其为单拷贝整合。该系统为后续研究提供了一个稳定且受控的遗传环境。

Transient chromatin editing with DNMT3A leads to permanent changes in gene expression

瞬时转染DNMT3A-dCas9并靶向报告基因上游区域后，基因表达被抑制，并在表观编辑器消失后（约11天后）维持在新的稳定状态。值得注意的是，不同剂量的DNMT3A编辑产生了跨越从完全沉默到完全激活整个范围的基因表达分布，而非仅有两个峰，这初步暗示了记忆的非二元性。MeDIP和ChIP分析证实，这种长期抑制伴随着报告基因区域DNA甲基化和H3K9me3水平的升高，以及H3K4me3水平的降低。

Transient chromatin editing with KRAB leads only to temporary changes in gene expression

与之形成鲜明对比的是，瞬时表达PhIF-KRAB（招募H3K9me3）虽能快速抑制基因表达，但在表观编辑器消失后，基因表达会迅速恢复到初始的活跃状态，无法建立长期记忆。ChIP分析显示，此过程中仅有H3K9me3水平升高，DNA甲基化水平未发生改变。这表明，单纯的H3K9me3增加不足以维持长期的基因沉默。

A model where DNA methylation drives H3Kme3 predicts analog memory

基于实验观察，研究人员提出了一个核心模型：DNA甲基化驱动了H3K9me3的建立（通过MeCP2等reader蛋白招募 writers），而H3K9me3反过来并不驱动DNA甲基化（缺乏正向反馈）。更重要的是，DNA甲基化本身无自催化性，且在维持酶DNMT1的作用下非常稳定， decay 速率极低。因此，任何通过DNMT3A设定的DNA甲基化“等级”（grade，即平均甲基化程度）都将被近乎永久地“冻结”并保持。该模型预测，任何一个初始的DNA甲基化等级都会对应一个稳定的基因表达水平，从而实现模拟记忆。

Fluorescence-activated cell sorting reveals non-binary epigenetic memory

为了验证模型预测，研究人员对经DNMT3A编辑后处于低、中、高不同表达水平的细胞群体进行了分选和长期培养。流式细胞术追踪显示，不仅低和高表达群体保持稳定，中间表达群体的分布也保持了长期稳定，并未收敛到两极，这直接证明了非二元记忆的存在。靶向亚硫酸氢盐测序证实，中间表达状态的细胞确实具有中间水平的DNA甲基化等级，且DNA甲基化水平与基因表达水平呈负相关。

Single-cell analysis reveals that a wide range of gene expression levels is maintained over time, along with the corresponding DNA methylation grade

研究进一步通过单细胞克隆扩增实验，以更高分辨率证明了模拟记忆的存在。他们从DNMT3A编辑的细胞中分选出93个单细胞克隆，这些克隆在培养超过5个月后，其基因表达水平呈现出一个从低到高的连续谱系，且每个克隆都稳定维持其特异的表达水平。对其中8个代表性克隆的靶向亚硫酸氢盐测序显示，它们的DNA甲基化等级同样呈现连续梯度变化，并与表达水平精确负相关。此外，中间甲基化等级的克隆表现出更高的甲基化程度变异性，这与模型引入DNMT1被H3K9me3招募并可能发生错误（de novo或维持失败）的机制后所做的预测一致。

DNA methylation drives the maintenance of analog gene expression states

最后，研究人员通过功能获得和功能缺失实验，确立了DNA甲基化与基因表达水平维持之间的因果关系。在稳定维持中间表达水平的细胞中，瞬时招募DNMT3A可使其永久沉默到低水平；瞬时招募TET1则可使其几乎完全且永久地重新激活。而再次瞬时招募KRAB仅能引起短暂的抑制，之后表达水平又恢复到之前的中间状态。用DNMT1抑制剂5-氮杂胞苷处理中间状态的克隆，则会导致基因表达记忆完全丢失，迅速恢复到完全活跃状态。这些实验强有力地证明，DNA甲基化等级是设定和维持特定基因表达水平的“分子调光旋钮”。

讨论与结论

本研究突破了表观遗传记忆传统上被认为是“二元”的范式，首次通过实验和理论证明了一种“模拟”表观遗传记忆的存在。其核心机制在于：DNA甲基化等级可以被精确设定并通过DNMT1的作用在细胞分裂中高度稳定地维持，从而像刻度尺一样“编码”并“记忆”相应的基因表达水平。而组蛋白修饰（如H3K9me3和H3K4me3）在此系统中主要扮演快速响应和执行DNA甲基化指令的角色，但其自身不足以维持长期状态。

研究强调，模拟记忆的出现关键在于DNA甲基化与H3K9me3之间缺乏正向反馈环路。在其它遗传或细胞背景中，如果存在这种反馈（即H3K9me3也能有效招募DNA甲基化酶），则系统更可能呈现出二元记忆的特性。这解释了为何此前在不同背景下的研究可能得出不同的结论。

这项发现具有深远的意义。首先，它极大地深化了对表观遗传调控基本原理的理解，为解释发育、分化及疾病过程中观察到的连续基因表达模式提供了新的理论框架。其次，它提供了强大的工具包（报告系统、编辑工具、数学模型），可用于在更多样的生理相关环境中探索表观遗传记忆的性质。最后，也是最具应用前景的一点，它为合成生物学和细胞工程开辟了新道路。通过编程控制DNA甲基化等级，理论上可以设计出能够稳定记忆任意指定基因表达水平的哺乳动物细胞，这在构建具有高分辨率空间 patterns 的类器官、工程化组织以及开发新型细胞疗法方面具有巨大的潜力。