综述：细胞通透性分析技术的进展

《Heliyon》：Advancements in techniques for analyzing cell permeability

本综述系统梳理了从传统Caco-2细胞模型到新兴类器官芯片及细胞球体等三维技术在细胞通透性研究中的应用，重点比较了各类方法（如PAMPA、MDCK、everted rat intestinal sac等）的优劣，并探讨了其与药物吸收、口服生物利用度（bioavailability）及肠道屏障功能的关联，为药物研发中渗透性预测模型的优化选择提供了重要参考。

细胞通透性是药物开发中的关键因素，直接影响治疗性化合物的吸收和生物利用度。本文全面回顾了用于分析细胞通透性的技术，从传统方法到创新方法，深入探讨了各种技术的特性、应用及局限性。

Caco-2细胞模型源于人结肠上皮癌细胞，在特定培养条件下可分化为具有刷状缘的单层细胞，其特性类似于小肠上皮细胞。该细胞表达多种膜肽酶、转运蛋白（如胰岛素转运蛋白、维生素D转运蛋白）和外排蛋白（如P-糖蛋白[P-gp]），是模拟人体肠道上皮的理想模型。标准培养条件下，Caco-2细胞需21天左右才能完全分化，形成具有高跨膜电阻（TEER > 300 Ω·cm2）的完整单层，并通过扫描电镜和标志物（如甘露醇）渗透性评估其完整性。尽管Caco-2模型广泛应用于药物肠道吸收、代谢及屏障功能研究，但其培养时间长、缺乏黏液层、细胞类型单一等局限促使了新模型的发展。

为克服这些局限，研究者开发了多种策略。例如，采用电纺纳米纤维支架可显著缩短培养时间至4天，并增强细胞分化和屏障功能。添加丁酸等分化诱导培养基也能在7天内获得功能性单层。此外，Caco-2与黏液生成细胞HT29-MTX的共培养模型引入了黏液层，更好地模拟了肠道环境，提高了对亲水性化合物渗透性的预测准确性。

Parallel Artificial Membrane Permeability Assay（PAMPA）作为一种非细胞模型，通过人工脂质膜模拟被动跨细胞转运，具有高通量、低成本的优势，但其无法模拟主动转运和旁细胞途径。研究表明，PAMPA与Caco-2在脂溶性药物渗透性数据上高度相关，但对于亲水性化合物预测能力较差。Double-Sink PAMPA等改进模型进一步提升了对人数据的预测准确性。

Madin-Darby Canine Kidney（MDCK）细胞系，特别是转染了人类MDR1基因的MDCK-MDR1细胞，因其快速生长（3-4天培养）和P-gp高表达，被广泛用于被动渗透性和外排转运研究。然而，其犬源来源和肾源特性可能导致与人类肠道模型的差异，因此在数据解读时需谨慎。

Everted rat intestinal sac模型则提供了一种离体肠道渗透性研究的方法，能够保留肠道结构的生理复杂性，包括血流和代谢酶的影响，但其依赖动物模型、样本间变异性大及伦理问题限制了其应用。

猪源细胞模型（如LLC-PK1、IPEC-J2）因其与人类肠道在基因组、生理和代谢上的相似性，逐渐成为研究肠道屏障、宿主-病原体相互作用及益生菌效应的有力工具。IPEC-J2细胞非肿瘤源性、快速极化及黏液分泌特性，使其在模拟人体肠道生理方面表现出色。

新兴的三维模型，如诱导多能干细胞（iPSCs）、器官芯片（organ-on-a-chip）和细胞球体（spheroids），正推动细胞通透性研究向更高生理相关性发展。iPSCs可分化为各种细胞类型，包括脑微血管内皮细胞，用于构建血脑屏障（BBB）模型，研究跨屏障药物渗透性。例如，iPSC衍生的BBB模型在22q11.2删除综合征研究中揭示了屏障完整性的破坏，与紧密连接蛋白（如claudin-5、occludin）减少相关。

器官芯片系统整合微流体和活细胞，模拟器官微环境及机械力，如剪切应力。例如，BBB-on-a-chip模型通过共培养内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，成功评估了药物跨屏障渗透性，与分配系数显著相关。类似地，胎盘-on-a-chip模型研究了葡萄糖跨胎盘屏障的转运，为母胎交换提供了新见解。

细胞球体模型则通过三维结构模拟组织架构，梯度分布营养和氧气，用于研究药物渗透性和抗药性。例如，肺癌A549细胞球体中，咖啡因通过降低claudin-2表达和氧化应激，增强了多柔比星的渗透性和毒性。肠道球体模型（如Caco-2球体）在预测药物吸收方面表现出优于PAMPA的相关性，与人体吸收数据相关性达85%。

总之，选择细胞通透性评估技术需基于化合物特性、吸收机制及可用资源。传统模型与创新方法的结合为药物开发提供了更精准的预测策略，未来需继续优化和标准化这些模型，以深化对细胞通透性及药物-细胞相互作用的理解。