基于G蛋白胞外域与M2 CTL表位的病毒样颗粒疫苗可诱导抗呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫并避免肺部疾病

《Frontiers in Immunology》：Virus-like particles containing the extracellular domain of G protein in combination with a CTL peptide of M2 elicit protection against respiratory syncytial virus infection without pulmonary disease

本推荐评述了一项关于呼吸道合胞病毒（RSV）新型疫苗的重要研究。研究者利用重组杆状病毒-昆虫细胞表达系统构建了含有RSV G蛋白胞外域（GECD）及M2蛋白细胞毒性T细胞（CTL）表位（M282-90）的病毒样颗粒（VLPs）疫苗。实验结果表明，该疫苗能诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，产生高效价中和抗体，并通过调节肺部Treg/Th17细胞比例，在提供保护的同时有效避免了疫苗增强性疾病（VED）的发生，展现出良好的应用前景。

　　

1 引言

呼吸道合胞病毒（RSV）感染是全球范围内婴幼儿和老年人面临的严重健康威胁。自然感染RSV后产生的免疫力并不完全，一生中可发生重复感染。上世纪60年代，福尔马林灭活RSV（FI-RSV）疫苗在后续感染中引发了疫苗增强性疾病（VED）。研究表明，VED与过度的Th2型免疫反应和低亲和力抗体的产生密切相关。尽管目前已有三种RSV疫苗获批用于60岁以上老年人或孕妇，但开发能够诱导平衡免疫反应和高亲和力抗体的有效疫苗仍是当务之急。

在mRNA疫苗因潜在不良反应而开发受阻的背景下，病毒样颗粒（VLPs）疫苗因其良好的免疫原性和安全性而受到广泛关注。表达在病毒颗粒表面的融合（F）和吸附（G）糖蛋白是RSV疫苗设计的主要靶点。F蛋白在RSV毒株间更为保守，其预融合（Pre-F）构象能诱导产生强效的RSV中和抗体且不引起肺部病理损伤，因此成为大多数疫苗候选物的主要靶标。

作为病毒表面的另一主要抗原，G蛋白的中心保守域（CCD）在流行毒株中高度保守。G蛋白通过其CX3C基序与人类支气管上皮细胞中的CX3C趋化因子受体（CX3CR1）结合，从而促进RSV感染。针对G蛋白的单克隆抗体（mAbs）能够中和RSV感染、降低病毒载量、减轻肺部炎症并恢复Th1/Th2平衡。抗G蛋白抗体还能增强宿主的干扰素反应，改善保护性早期抗病毒反应，这对疫苗和治疗设计具有重要意义。值得注意的是，G蛋白的存在能增强F蛋白在VLP疫苗候选物中的免疫原性，从而以更高的中和抗体滴度提供更好的RSV感染保护。因此，含有G蛋白的RSV疫苗是增强免疫力的有前景策略。

通过重组杆状病毒表达系统生产的病毒样颗粒（VLPs）已被广泛认为是有效的疫苗平台。针对乙型肝炎病毒（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）的VLP疫苗已上市销售。含有RSV G蛋白的VLPs在体内诱导保护作用，具有高免疫原性且未观察到病理增强，是很有前景的RSV疫苗候选物。

2 材料与方法

2.1 细胞、病毒和紫外灭活病毒的制备

HEp-2和Vero细胞购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC；中国武汉），在添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。Sf9细胞在本实验室保存，在SF-900 II无血清培养基（SFM）中于27°C培养。RSV A2株在HEp-2细胞中增殖，病毒滴度在Vero细胞中测定。RSV的纯化和灭活如前所述。通过噬斑试验检测紫外辐射灭活RSV的效率。

2.2 质粒和重组杆状病毒的构建

为生产以G蛋白为主要表面抗原的病毒样颗粒（VLPs），我们优化了构建方式，用H1N1血凝素（HA）的胞质尾（CT）和跨膜（TM）区替换了RSV G蛋白的相应区域，然后连接到G_ECD片段（氨基酸65-298）的N末端。为提高G_ECD-VLPs疫苗的功效，我们将RSV M2蛋白的aa82-90表位纳入设计，该表位在H-2^d小鼠中是一种保护性抗原。使用柔性接头（GGGGS）₃将RSV G_aa65-298与M2_aa82-90串联构建，形成G_ECD/M2_82-90-VLPs。经过对昆虫细胞使用的密码子优化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成编码G_ECD或G_ECD/M2_82-90的嵌合基因。

通过PCR扩增嵌合G_ECD片段，经EcoR I和Xba I酶切后，克隆到pFBDM载体中创建质粒pFBDM-G_ECD。类似地，将G_ECD/M2_82-90片段插入pFBDM中生成质粒pFBDM-G_ECD/M2_82-90。使用相同方法将M1基因克隆到pFBDM中获得pFBDM-M1。通过测序鉴定构建的质粒。如前所述，分别将pFBDM-G_ECD、pFBDM-G_ECD/M2_82-90或pFBDM-M1转化到感受态E.coli DH10 MultiBac细胞中生成杆状病毒质粒DNA（bacmid）。将得到的bacmid DNA转染Sf9细胞，分别产生重组杆状病毒rBV-RSV-G_ECD、rBV-RSV-G_ECD/M2_82-90或rBV-IAV-M1。通过噬斑试验测定杆状病毒滴度。

2.3 VLPs的生产和纯化

用rBV-IAV-M1和rBV-RSV-G_ECD或rBV-RSV-G_ECD/M2_82-90（各自MOI=1.0）共感染Sf9细胞。培养3天后，收获Sf9细胞培养物并保存于-80°C备用。分析VLP形成后，裂解细胞培养物，以5000 rpm离心30分钟澄清裂解液。然后将含有VLPs的上清液在4°C下以60,000×g超速离心6小时。将沉淀重悬于含有0.15 M NaCl和0.05 M磷酸盐（PBS，pH 7.2）的磷酸盐缓冲液中。使用HiPrep Sephacryl S-500 HR（GE Healthcare，德国）以0.5 mL/min的流速在室温下分离VLPs，按照制造商的推荐方案进行。收集A280>0.1的蛋白吸光度值的组分作为样品，组分收集体积约为10 mL。随后使用Bradford蛋白测定试剂盒（生工生物工程股份有限公司）测定纯化的VLPs。

2.4 SDS-PAGE、Western blot和电子显微镜分析

通过Western blot分析VLP的形成，并通过SDS-PAGE和电子显微镜确认纯化的VLPs，如前所述。收集用重组杆状病毒感染72小时的细胞，以未感染细胞作为阴性对照。用裂解缓冲液处理后，加入一定比例的上样缓冲液，充分混合样品并煮沸10分钟。通过SDS-PAGE分析制备的样品以检测目标蛋白的表达。

使用小鼠抗RSV G单克隆抗体（北京义翘神州科技股份有限公司，中国）或抗M1单克隆抗体克隆36H4（Immune Tech，美国）通过Western blot分析鉴定目标蛋白的表达。将纯化的样品稀释至200 μg/mL，取10 μL蛋白样品滴加到铜网的碳膜面上，室温孵育5分钟使其吸附。然后用滤纸吸去残留的蛋白溶液，在同一位置加入10 μL 2%磷钨酸进行负染色，室温放置1-2分钟。之后，用滤纸吸去剩余的负染液，室温干燥铜网后储存或直接在透射电子显微镜下观察。设置电压为100 kV，在120,000倍放大倍数下观察病毒样颗粒。通过透射电子显微镜（JEM-2100，JEOL，日本东京）检查VLPs的形态。

2.5 动物实验

动物实验如前所述进行。每组五只6至8周龄无特定病原体（SPF）雌性BALB/c小鼠（武汉大学动物实验中心）以2周间隔肌肉注射（i.m.）免疫三次，每次100 μL体积中含10 μg VLPs。UV-RSV组五只动物用纯化的UV-RSV（1×10⁵ PFU）以100 μL体积进行肌肉注射免疫，阴性对照组用相同体积的PBS进行肌肉注射。免疫后第14天收集的血清用于检测抗体滴度。从分离的脾淋巴细胞中测定细胞因子。

对于组织学分析，免疫后第14天，用3×10⁶ PFU/100 μL的RSV滴鼻（i.n.）攻击免疫小鼠。攻击后4天（dpc），用苏木精和伊红（H&E）或高碘酸-希夫（PAS）染色小鼠肺部，分别用于常规组织学或黏液分泌检查。如前所述对肺部炎症评分进行分级。

2.6 中和抗体测定

通过50%空斑减少中和试验（PRNT₅₀）评估针对RSV的中和抗体滴度，如前所述。将小鼠血清在DMEM中进行2倍系列稀释。将约100 PFU RSV的100 μL等分试样与稀释的血清混合孵育。随后将混合物添加到预先洗涤的Vero细胞中。孵育2小时后，用甲基纤维素替换混合物，然后孵育3至5天。如前所述对空斑进行染色。中和抗体滴度定义为导致病毒滴度减少50%的血清最高稀释度的log₂值（PRNT₅₀）。

2.7 酶联免疫吸附测定

以RSV作为包被抗原，通过ELISA评估病毒特异性IgG、IgG2a和IgG1抗体。将灭活的RSV（1×10⁵ PFU/孔）作为包被抗原置于96孔板中，然后加入梯度稀释的免疫小鼠血清。37°C孵育1小时后，将HRP标记的IgG、IgG2a或IgG1（艾博抗）二抗加入96孔板中。然后，加入TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）作为底物进行检测（Sigma）。根据450 nm处的吸光度值确定抗体滴度。

使用ELISA定量测定细胞因子浓度，如前所述。使用ELISA试剂盒（BioLegend，美国圣地亚哥）定量测定培养细胞上清液或肺匀浆中的Th1（TNF-α、IL-2、IFN-γ）、Th2（IL-4、IL-5）和Th17相关（IL-17A）细胞因子。

2.8 ELISpot

使用ELISpot试剂盒（Mabtech，瑞典）检测IFN-γ水平，按照制造商的说明进行操作。用PBS清洗ELISpot板四次后，加入补充有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基孵育1小时。然后加入脾淋巴细胞悬液（1×10⁶），并用10 μg/mL M2_82-90（SYIGSINNI）在37°C、5% CO₂条件下刺激细胞24小时。刺激后，用洗涤缓冲液（PBS中含0.05% Tween-20）清洗板四次。随后加入抗小鼠IFN-γ检测抗体，然后将板在4°C下孵育过夜。然后去除检测抗体，彻底清洗板。最后使用ELISPOT读数器量化斑点。RSV特异性ELISpot数量的计算涉及从每种细胞类型的三复孔中的ELISpot减去未刺激孔中的平均ELISpot。

2.9 流式细胞术

按照先前概述的方法进行细胞染色。对于Treg分析，用针对CD4（克隆RM4-5，FITC标记，BioLegend，美国）和CD25（克隆PC61，APC标记，BioLegend）的特异性单克隆抗体对细胞进行表面染色。固定和透膜后，使用PE标记的抗小鼠Foxp3抗体（克隆MF-14，BioLegend）进行细胞内染色。对于Th17分析，在体外刺激后对细胞进行表面或细胞内蛋白染色。用细胞激活 Cocktail（含有PMA、离子霉素和布雷菲德菌素A；BioLegend）在补充有10% FCS的RPMI中于37°C刺激细胞6小时。然后对CD4进行表面染色，固定并在细胞内染色perm/wash缓冲液中透膜，随后使用PE标记的针对IL-17A的特异性单克隆抗体（克隆TC11-18H10.1，BioLegend）进行细胞内染色。通过流式细胞仪（BD FACSCanto? II，美国）分析染色的细胞。流式细胞术分析使用的设门策略见补充图S1。数据呈现为CD4⁺ T细胞群体中CD25⁺Foxp3⁺（Treg）细胞或产生IL-17A的（Th17）细胞的百分比。

2.10 实时逆转录定量PCR

根据先前的描述，使用RT-qPCR定量肺中的RSV载量。使用RNA Pure试剂（艾德莱，中国北京）从肺组织中提取总RNA，并使用Toyobo试剂盒（日本大阪）将RNA逆转录成cDNA。使用2×SYBR Green Master Mix（诺唯赞，中国）在Applied Biosystems的7500实时PCR系统上进行RSV N基因拷贝数的检测。RT-qPCR的引物序列列于表1。

2.11 统计分析

使用Student's t检验或方差分析（ANOVA）进行不同组间的比较。使用Tukey检验或非参数Kruskal-Wallis检验进行进一步分析。P值低于0.05被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 自组装G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs的制备和表征

为生产G_ECD-VLPs，用rBV-RSV-G_ECD和rBV-IAV-M1共感染Sf9细胞。培养72小时后，收集感染的Sf9细胞裂解物上清液用于后续检测。Western blot分析显示，RSV G_ECD和IAV M1蛋白在感染的Sf9细胞中均有效表达。类似地，在用rBV-RSV-G_ECD/M2_82-90和rBV-IAV-M1共感染的Sf9细胞上清液中观察到RSV G_ECD/M2_82-90和IAV M1蛋白。然后如材料和方法中所述，从rBV感染的Sf9细胞上清液中纯化VLPs。SDS-PAGE分析显示，纯化的G_ECD-VLPs由G_ECD和M1组成，而G_ECD/M2_82-90-VLPs含有G_ECD/M2_82-90和M1蛋白。电子显微镜显示球形自组装VLPs，大小在50至100纳米之间。结果表明，G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs是从rBVs感染的Sf9细胞上清液中制备的。

3.2 接种G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs引发RSV特异性体液免疫反应

为评估嵌合VLPs诱导的体液免疫反应，测量了接种疫苗小鼠血清中的RSV特异性抗体水平。数据显示，接种G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs能有效诱导小鼠产生RSV特异性抗体。与UV-RSV相比，接种G_ECD-VLPs或G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导了相似的RSV特异性IgG水平。接种G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs的小鼠IgG2a/IgG1比值分别为1.10和1.20，而UV-RSV免疫产生了Th2偏向的免疫反应，比值为0.96。向更高IgG2a/IgG1比值的转变表明VLP诱导的免疫反应具有更强的Th1极化，这对于有效的抗病毒保护是可取的。接种G_ECD-VLPs或G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导的RSV中和抗体（NAb）与UV-RSV组相似。这些发现表明，G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs引发了对RSV的平衡免疫反应。G_ECD与CTL表位M2_82-90的组合并未增强VLPs在小鼠中引发的中和抗体水平。通过增强Th1型免疫，G_ECD/M2_82-90-VLPs配方可能在保持对RSV感染强大保护的同时降低VED的风险。

3.3 G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导的细胞免疫反应

为确定G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导的细胞免疫反应，制备接种疫苗小鼠的脾细胞悬液，进行培养，然后暴露于10⁵ PFU的热灭活RSV病毒。检测了Th1型细胞因子（TNF-α、IL-2、IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-5）。G_ECD-VLPs组和G_ECD/M2_82-90-VLPs组均能诱导特异性细胞免疫反应。与UV-RSV组相比，G_ECD/M2_82-90-VLPs组导致TNF-α、IL-2、IFN-γ水平升高，并降低了IL-5浓度。数据表明G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导了增强的Th1型反应和减弱的Th2反应。

根据文献报道，RSV的M2蛋白在H-2^d小鼠中是一种保护性抗原，但在H-2^b或H-2^k小鼠中则不是。数据显示，在UV-RSV组和G_ECD/M2_82-90-VLPs组中均观察到M2（82-87）肽特异性IFN-γ的产生。在G_ECD/M2_82-90-VLPs组中，IFN-γ水平显著高于UV-RSV组。相比之下，在G_ECD-VLPs组中未检测到M2肽特异性的IFN-γ细胞因子。数据表明，G_ECD/M2_82-90-VLPs中的CTL表位M2_82-90特异性激活T细胞。

3.4 RSV攻击后接种VLPs的小鼠肺部病毒载量和病理学

为评估VLPs对RSV感染的保护作用和诱导的肺部病理学，我们在攻击后4天测量了接种疫苗小鼠肺部的RSV浓度。通过RT-qPCR检测小鼠肺部RSV N基因拷贝数。数据显示，PBS组检测到约10⁶个RSV N基因拷贝。然而，接种G_ECD-VLPs或G_ECD/M2_82-90-VLPs的小鼠肺部RSV浓度极低（与背景水平相似）。

评估了RSV感染后接种疫苗小鼠的肺部组织病理学变化。UV-RSV免疫组小鼠在肺泡出血、血管和间隙周围显示出严重的淋巴细胞浸润，以及肺部产生PAS阳性黏液。相比之下，接种G_ECD-VLPs的小鼠肺部仅表现出轻度炎症，而G_ECD/M2_82-90-VLPs组在气道和间隙周围未显示明显的细胞浸润或黏液产生迹象。接种疫苗的小鼠肺部炎症严重程度平均评分如下：UV-RSV > PBS > G_ECD-VLPs > G_ECD/M2_82-90-VLPs。这些发现表明，接种G_ECD/M2_82-90-VLPs成功保护小鼠免受RSV感染，且未引发疫苗增强的免疫病理学，表明G_ECD/M2_82-90-VLPs可能是一种有前景的RSV疫苗候选物。

3.5 G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs诱导的肺组织细胞免疫反应

CD4⁺ T细胞的特定亚群和Th2型细胞因子在RSV疫苗增强的免疫病理学恶化中至关重要。RSV攻击后，检查了接种疫苗小鼠的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Tregs）和产生IL-17A的CD4⁺ T细胞亚群。数据显示，与UV-RSV相比，接种VLPs显著提高了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Tregs并显著减少了产生IL-17A的CD4⁺ T细胞。类似地，与G_ECD-VLPs相比，融合了M2表位的G_ECD在RSV攻击后诱导了显著增加的肺部CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Tregs和显著减少的CD4⁺IL-17A⁺ T细胞，表明接种G_ECD/M2_82-90-VLPs的小鼠在RSV感染后能够诱导更高的Treg细胞水平和减少的Th17细胞产生，从而在体内实现对Treg/Th17更平衡的细胞免疫反应。

我们进一步研究了攻击后4天接种G_ECD-VLPs和G_ECD/M2_82-90-VLPs小鼠肺匀浆中的代表性细胞因子。与UV-RSV相比，在G_ECD/M2_82-90-VLPs组和G_ECD-VLPs组中观察到显著增加的Th1细胞因子和显著降低的Th2细胞因子浓度。重要的是，与G_ECD-VLPs相比，接种G_ECD/M2_82-90-VLPs的小鼠肺匀浆中IFN-γ、IL-2显著增加，而IL-5细胞因子显著减少。与UV-RSV相比，接种G_ECD/M2_82-90-VLPs和G_ECD-VLPs诱导了更多的IL-10分泌和更少的IL-17A含量，这证实了流式细胞术的数据。

4 讨论

开发针对RSV感染的疫苗或免疫预防措施的努力仍在持续进行。值得注意的是，上世纪60年代末的一项福尔马林灭活RSV（FI-RSV）疫苗的早期试验未能证明其有效性和安全性。尽管遭遇挫折，最近的进展已导致几种疫苗和单克隆抗体获批，这标志着RSV预防策略的重大转变。然而，针对儿童的普遍有效RSV疫苗仍然缺位。开发安全有效RSV疫苗的一个主要障碍是疫苗增强性疾病（VED）。VED的特征是肺部嗜酸性粒细胞浸润、低亲和力抗体和Th2偏向反应。继FI-RSV疫苗失败后，随后的疫苗开发重点集中在实现强大的免疫原性而不诱导VED上。这导致了对旨在引发高亲和力抗体和Th1偏向免疫反应的优化疫苗设计的探索。基于RSV F、G和/或M蛋白的各种RSV疫苗候选物，包括亚单位、颗粒和载体疫苗，数量不断增长。这些候选物已在各种平台上得到广泛研究。

RSV中和抗体由两个关键表面糖蛋白F和G蛋白触发，它们被广泛用于开发RSV疫苗候选物。在不同RSV毒株中，F蛋白更保守，预计能引发更广泛的保护性免疫。帕利珠单抗（Palivizumab）是一种已获许可的RSV单克隆抗体药物，其识别RSV F蛋白中的一个表位。因此，F蛋白是当前大多数处于临床前和临床开发阶段的疫苗候选物的主要焦点。然而，G糖蛋白也是RSV疫苗开发的重要靶抗原，因为它能诱导长期的中和活性并阻断CX3C-CX3CR1相互作用。重要的是，在G蛋白的胞外域中，存在一个具有CX3C趋化因子基序的高度保守域（CCD），它能引发产生广泛有效的中和抗体。

VLPs被认为是