猪流行性腹泻病毒通过Caspase-1介导MAVS蛋白切割逃逸宿主IFN-β抗病毒免疫的新机制

《Virulence》：Novel strategies for PEDV to interfere with host antiviral immunity through Caspase-1

本研究发现猪流行性腹泻病毒（PEDV）通过稳定Caspase-1表达，特异性切割线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的Asp182位点，从而抑制I型干扰素（IFN-β）产生并促进病毒复制。该机制在人和猪细胞中均存在（切割位点分别为D276/D182），揭示了一种跨物种保守的病毒免疫逃逸策略，为开发靶向Caspase-1-MAVS通路的抗PEDV疗法提供了新靶点。

　　

ABSTRACT

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是造成新生仔猪高死亡率的重要冠状病毒病原。本研究揭示PEDV通过靶向Caspase-1-线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）轴抑制I型干扰素（IFN-β）产生的分子机制。PEDV感染显著提升宿主细胞和组织中Caspase-1蛋白表达水平，而不影响其mRNA转录。过表达Caspase-1可促进PEDV复制，同时显著抑制病毒或poly(I:C)刺激引发的IFN-β和ISG15产生。

INTRODUCTION

冠状病毒科成员PEDV自1971年发现以来，对养猪业持续造成重大经济损失。先天免疫系统中的I型干扰素（IFN）反应是宿主抗病毒防御的核心环节，而病毒已进化出多种策略来逃逸或抑制宿主免疫应答。MAVS作为RIG-I样受体（RLRs）信号通路的关键衔接蛋白，在启动IFN-β产生中发挥重要作用。Caspase-1是炎症小体通路中的关键蛋白酶，负责切割IL-1β和IL-18前体并激活gasdermin D（GSDMD）诱导细胞焦亡。然而，Caspase-1在抗病毒天然免疫中的调控作用尚不完全清楚。

RESULTS

Caspase-1 attenuates IFN-β signaling during PEDV infection

在PEDV自然感染仔猪的肠组织及感染PEDV的IPEC-J2细胞中，Caspase-1蛋白表达显著上调，而mRNA水平未发生变化。过表达Caspase-1的IPEC-J2细胞感染PEDV后，病毒复制显著增强。同时，Caspase-1有效抑制了PEDV感染或poly(I:C)刺激引发的IFN-β和ISG15表达，表明PEDV通过稳定Caspase-1蛋白来促进复制并抑制IFN-β产生。

Caspase-1 targets MAVS to inhibit IFN-β signaling

通过荧光素酶报告基因实验发现，Caspase-1显著抑制MAVS介导的IFN-β启动子激活，并降低MAVS蛋白表达。Co-IP实验证实Caspase-1与MAVS存在直接相互作用，即使酶活缺失突变体（C285A）仍能与MAVS结合。共聚焦显微镜观察显示两者在细胞内共定位。在IPEC-J2细胞中，MAVS过表达可抑制PEDV复制并促进IFN-β和ISG15产生，而共表达Caspase-1则逆转了这一效应，显著促进病毒复制。

Caspase-1 cleaves MAVS at Asp182

使用Caspase-1特异性抑制剂VX765处理可挽救由Caspase-1引起的MAVS蛋白减少。酶活缺失突变体Caspase-1-C285A无法介导MAVS切割。通过N端Myc标签检测到约20 kDa的MAVS切割片段。点突变筛选确定猪MAVS的Asp182为Caspase-1的关键切割位点，D182A突变体能完全抵抗Caspase-1的切割。

Cleavage of MAVS by Caspase-1 inhibits IFN-β production and promotes viral replication

在IPEC-J2细胞中，共表达Caspase-1与MAVS-D182A突变体相比野生型MAVS，在PEDV感染或poly(I:C)刺激下能诱导更强的IFN-β和ISG15表达，并更有效抑制病毒复制。单独表达MAVS-D182A突变体也显示出比野生型MAVS更强的抗病毒活性，表明Caspase-1对MAVS的切割削弱了其抗病毒功能。

None of the cleaved fragments of MAVS effectively activate IFN-β

构建MAVS切割片段MAVS-A（1-182aa，含CARD结构域）和MAVS-B（183-524aa，含TM结构域）。全长MAVS能显著诱导IFN-β产生并抑制PEDV复制，而两个片段均丧失此功能。poly(I:C)刺激实验显示，切割片段无法有效激活IRF3磷酸化。Co-IP实验表明片段失去与TBK1和IKK-ε的结合能力。SDD-AGE分析显示MAVS-A片段虽能与全长MAVS结合，但其寡聚化能力显著降低，这解释了其功能缺失的原因。

Species differences in the cleavage of Caspase-1 on MAVS

人源Caspase-1同样与MAVS相互作用并切割MAVS，但切割位点位于Asp276（而非猪源的Asp182）。人MAVS-D276A突变体抵抗Caspase-1切割，并在poly(I:C)刺激下产生更多IFN-β。人源MAVS切割片段（1-276aa和277-540aa）同样无法激活IRF3磷酸化或诱导IFN-β产生，表明不同物种间切割位点虽不同，但功能影响保守。

DISCUSSION

本研究首次揭示PEDV通过稳定Caspase-1表达，使其切割MAVS并抑制IFN-β产生的免疫逃逸新机制。与以往关注病毒蛋白直接干扰IFN的研究不同，该工作突出了宿主蛋白Caspase-1在PEDV感染中的双重角色：既参与炎症反应，又成为病毒利用的免疫逃逸工具。值得注意的是，尽管PEDV编码的nsp5和PLP2蛋白分别切割GSDMD和稳定Caspase-1，但早期感染阶段并未出现显著细胞焦亡，提示Caspase-1可能优先发挥抑制IFN的作用，为病毒复制创造时间窗口。跨物种比较显示人源和猪源MAVS切割位点不同（D276 vs D182），但功能结局一致，表明该机制在进化上保守。针对Caspase-1-MAVS通路的抑制剂（如VX765）可能成为抗PEDV治疗的新策略。

CONCLUSION

PEDV通过上调Caspase-1表达，特异性切割MAVS蛋白，从而抑制IFN-β产生并促进自身复制。该机制在人和猪细胞中均存在，但切割位点具有物种特异性。这些发现为理解冠状病毒免疫逃逸机制提供了新视角，并为开发靶向Caspase-1-MAVS通路的抗病毒策略奠定了理论基础。