综述：地衣内生真菌次级代谢产物生物勘探在药物发现应用中的最新生物技术进展

本综述系统探讨了地衣内生真菌（ELF）作为新型天然产物来源的巨大潜力。文章重点介绍了利用一株多化合物（OSMAC）策略、代谢组学引导分析、共培养系统和表观遗传修饰剂等现代生物技术手段来激活ELF沉默的生物合成基因簇（BGC），从而拓展其代谢多样性。同时，综述还展望了整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和多组学分析，并结合人工智能（AI）与机器学习（ML）等先进计算工具，为加速ELF活性天然产物的发现和开发提供了前瞻性框架。

Abstract

地衣内生真菌（ELF）是栖息于地衣中的共生生物。自其天然产物和药物发现应用的首次报道以来，它们已成为具有广泛结构多样性和生物活性化合物的独特宝贵来源。本综述批判性地审视了当前扩大ELF代谢物多样性的策略，重点介绍了一株多化合物（OSMAC）方法和代谢组学引导的分析。我们强调了共培养系统、表观遗传修饰剂和先进的数据获取平台如何为化学空间探索开辟新途径。尽管ELF中的基因组和转录组研究仍然有限，但它们揭示了未开发的生物合成潜力，并指向整合组学 pipeline。最近的计算和人工智能工具进一步加速了基因组-代谢组挖掘、结构解析和生物活性预测。我们提出了一个结合OSMAC、整合组学和AI的前瞻性框架，以最大化ELF的天然产物生物勘探潜力，同时揭示它们在地衣全息组内的生态作用。

1. Introduction

1.1. Endolichenic fungi

多年来，地衣被认为是一种复杂生物体，由一种称为 mycobiont 的丝状真菌与一种或多种光合生物（绿藻或蓝细菌，称为 photobiont）共生。然而，第三种共生组分——担子菌酵母的发现导致了修订的定义：“地衣是由一种exhabitant真菌与一种或多种光合伙伴的细胞外排列以及数量不确定的其他微生物相互作用形成的自持生态系统。”这一定义得到了研究的支持，这些研究确定了地衣内多样的细菌群落，称为地衣内生细菌。此外，还描述了另一类独特的丝状真菌，它们互利共生地栖息于地衣中，称为地衣内生真菌（ELF）。因此，这些发现支持了地衣作为多样化微生物群落宿主的新兴概念。

ELF不会造成伤害，并且不在地衣叶状体内产生孢子结构。它们在地衣学分类和功能上不同于地衣中的主要真菌伙伴 mycobiont，也不同于地衣生真菌，后者是一类已知在其地衣宿主中引起可见症状的寄生真菌。它们也被认为相对于其地衣宿主是兼性的而非专性的，意味着ELF物种并非特定于某一地衣宿主。

1.1.1. ELF biodiversity

据估计，全球约有13,500种ELF物种。为了全面评估ELF多样性，应采用传统的非培养依赖方法和培养依赖方法，如元条形码技术，因为一些ELF是不可培养的。在最近的一篇综述中，迄今已报道了约500种ELF，其中135种已鉴定到物种水平。它们主要属于子囊菌门Pezizomycotina亚门，并且在系统发育上与几个目相关，包括Ploesporales、Xylariales和Hypocreales。因此，迄今为止，大约4%的估计ELF物种已被探索。此外，所报道的ELF地衣宿主大多属于叶状和枝状地衣，仅代表114个已知物种。这仅占约20,000个已报道地衣物种的一小部分，并且可能还有更多地衣物种有待描述。所有这些都指出，大量的ELF正等待被揭示用于生物多样性研究和其他应用。显然，ELF生物多样性研究是有限的，应该进行以弥补这一巨大差距。

1.1.2. Chemical diversity of ELF

ELF是已知的生物活性次级代谢产物生产者。关于ELF天然产物的第一份报告是由Paranagama等人（2007）在Corynespora sp.中进行的。从那时起，许多研究报道了ELF次级代谢产物，包括生物碱、甾体、萜类、醌类、口山酮、肽和色原酮，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌、抗真菌、抗阿尔茨海默病和紫外线防护活性。Zhang等人（2024）的最新综述涵盖了2015年至2023年的文献。在该综述记录的407种ELF化合物中，270种（约66%）是新报道的，其中聚酮化合物是主要类别，其次是生物碱、萜烯、甾体和其他结构组。值得注意的是，自2015年以来，每年平均有30种新的ELF次级代谢产物被报道。大多数ELF的收集和采样在亚洲进行，其中中国的报告数量最多。这种地理集中性突出了其他生物多样性地区和国家的未开发潜力。

1.1.3. Comparative insights on ELF and endophytic fungi

内生真菌是生活在植物组织内的互利共生体，类似于地衣相关的ELF。两者在分类学上都属于同一主要纲（Pezizomycotina），并表现出相似的进化谱系。尽管非常相似，但ELF和内生真菌在操作分类单元（OTU）水平上存在显著差异，这表明它们在生态专业化和生物合成能力上存在潜在差异。这种差异需要通过比较基因组学方法进行更深入的研究，这不仅可以阐明分类学上的分歧，还可以阐明其次级代谢的遗传和功能基础。

内生真菌已知赋予其植物宿主各种益处，包括增强对非生物胁迫（如干旱、盐度、高温、食草动物和病原微生物）的抗性。这些保护作用通常由生物活性次级代谢产物的产生所介导。相比之下，ELF的具体生态作用及其产生的代谢物仍然知之甚少，需要进一步研究。然而，由于ELF能够产生结构多样且具有生物活性的化合物，人们对它们的兴趣与日俱增。对其化学生态学的平行研究将为了解它们在地衣叶状体内的共生作用带来进一步的见解。

内生真菌作为具有药学价值的次级代谢产物的多产来源已被广泛研究。最近的一篇综述记录了十年期间（2011-2021）从真菌内生菌中发现的220种新化合物，平均每年产生22种新代谢物。相比之下，2015年至2023年间的ELF研究每年报道约30种新化合物。尽管这些数字应谨慎解释，考虑到采样努力、研究重点和方法可能存在的差异，但这一趋势表明，由于ELF相对未被充分探索，其新化学物质的产出率很高。

在方法上，从宿主地衣中分离ELF密切遵循真菌内生菌分离的既定方案。具体的工作流程是相似的，包括野外采集、表面灭菌、切割地衣叶状体、接种到培养基上、传代培养直至培养物保存。与内生菌一样，每一步都至关重要，因为变化会显著影响分离成功率和观察到的真菌多样性。这些程序上的相似性强调了ELF用于基于培养的研究的实际可及性。

尽管它们共享分类学、进化谱系和方法学上的可及性，但由于其高化学新颖性，ELF为天然产物药物发现的持续探索提供了一个令人信服的理由。虽然内生真菌已被广泛研究，但ELF仍然相对未被充分探索，而其次级代谢产物的产量表明其具有未开发的生物合成能力。此外，互补的基因组挖掘策略将阐明这些生物合成潜力。这突出了ELF作为新天然产物有前景的储存库，在生物勘探、化学生态学和药物开发方面提供明显优势，特别是在未充分研究的地理区域和地衣宿主中。因此，本综述的主要目的是描述和综合现有的ELF天然产物生物勘探研究，并将互补的创新技术汇集在一起，以带来对ELF次级代谢的系统级理解。

2. Strategies to expand metabolite diversity of ELF: OSMAC strategies

正如最近一篇综述所述，迄今为止报道的ELF衍生化合物中只有大约一半代表新的化学实体，其余是已知代谢物。这种有限的新颖性部分是由于许多生物合成基因簇（BGC）在标准培养条件下保持沉默或不表达。培养依赖方法，如一株多化合物（OSMAC）方法，通过改变营养方案和培养基组成、培养参数（pH、搅拌、光照、温度）、与其他微生物共培养以及添加表观遗传修饰剂来增强次级代谢物的发现。通过遵循这种方法，通过激活标准或正常条件下的隐性BGC，改善了真菌和其他微生物的次级代谢物多样性。

OSMAC策略已被广泛用于使内生真菌和海洋生物的代谢产物多样化。目前，有九篇已发表的论文在ELF背景下使用了OSMAC方法。图2显示了ELF在不同培养基中产生的次级代谢物结构集合。当ELF Ulocladium sp.在查氏液体培养基中生长与在固体大米培养基中生长时，其粗提物中发现了不同的薄层色谱（TLC）谱图。进一步的分离工作导致鉴定了三种新的萜类化合物，tricycloalternarenes F-H（1-3）以及十种已知的tricycloalternarenes。此外，当同一种真菌在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中培养时，分离出了一类新型的萜类：sesterterpenes, ophiobolins P–T (4–8) 和三种已知的sesterterpenes。强调了Ophiobolin T (8) 具有细胞毒性和抗菌活性。当源自地衣Cetraria inslandica的Myxotrichum sp.在PDB中培养时，获得了新的代谢物，包括一个austdiol衍生物myxodiol A (9)，三个fulvic acid衍生物myxotrichin A–C (10–12)，和一个citromycetin衍生物myxotrichin D (13)。然而，当Myxotrichum sp.在固体大米培养基中生长时，鉴定出了三种新的聚酮化合物myxotritones A-C (14-16)，以及一个新的天然产物7,8-dihydro-7R, 8S-dihydroxy-3, 7-dimethyl-2-benzopyran-6-one (17)。化合物16显示出对拟南芥根伸长的抑制活性，这可能与其宿主地衣的防御有关。从在米饭中培养的ELF Nodulosporium sp.中分离出了两种新的孕甾烷类化合物，nodulisporisteriods A and B (18-19)。另一方面，当同一种ELF在PDB中生长时，鉴定出了另外十种新的孕甾烷类化合物，nodulisporisteriods C to L (20-29)。当来自Ramalina peruviana的ELF Xylaria sp.在固体大米培养基中生长时，观察到比在液体培养基麦芽提取物葡萄糖酵母提取物蛋白胨肉汤中更好的抗氧化活性。一项涉及几种在PDA、MEA和SAB中生长的ELF的研究发现了不同的形态和生物膜抑制活性。来自Parmotrema tinctorum的十四种ELF在四种不同的培养基中培养，包括牛肉蛋白胨葡萄糖肉汤（BPDB）、麦芽酵母提取物肉汤、PDB和固体燕麦片培养基。大多数ELF在BPDB中培养时显示出显著的活性。特别是，Chaetomium globosum和Nodulosporium sp.对植物病原真菌表现出显著的效力。从上述研究可以明显看出，不同的培养基影响了结构独特代谢物的产生，并可以改善生物活性。

除了培养基变化之外，OSMAC方法还可以通过同样影响次级代谢的替代策略来扩展。调整培养参数——如金属或盐浓度、pH、温度、搅拌、孵育时间、光照和氧气可用性——已被证明会影响代谢物的生物合成。另一种有效的技术是共培养策略，其中两种或多种微生物在同一个培养容器中一起生长。通过这种方式，它模拟了自然界中微生物复杂的生态关系，并常常导致新化合物的产生。例如，将Streptomyces sp.与Bacillus sp.共培养导致了dentigerumycin E的发现，这是一种含有哌嗪酸的环肽，具有抗癌活性。此外，共培养方法已在内生真菌中成功证明，该技术刺激了否则无法检测到的代谢物的产生，并揭示了它们与宿主的生态相互作用。在ELF的背景下，共培养可能有助于重建其在地衣叶状体内的自然栖息地，通过次级代谢物的产生提供对种间相互作用的有价值的见解。

另一种OSMAC策略涉及使用化学诱导剂进行表观遗传调控，这些诱导剂可以激活沉默的生物合成基因簇或提高已知代谢物的产量。这些化合物是表观遗传酶的合成小分子抑制剂，如DNA甲基转移酶（DNMT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和组蛋白乙酰转移酶（HAT），这使得特定的BGC可用于下游表达。例如，通过添加DNMT抑制剂5-氮杂胞苷，显著增强了内生菌中抗癌生物碱camptothecin的产量。类似地，用HDAC抑制剂伏立诺他（@100 μM）处理海洋来源的真菌Aspergillus terreus RA2905，改变了其代谢谱，导致发现了四种新代谢物：一对asperfuranone对映体和两种苄基吡喃酮（asperpyranones A and B）。这些代谢物表现出显著的生物活性，包括对白色念珠菌的抗真菌作用、PTP1B抑制，以及asperpyranone A对铜绿假单胞菌的抗菌活性。这些例子清楚地说明了表观遗传修饰剂如何唤醒隐秘的生物合成潜力并使真菌可及的化学空间多样化。

总而言之，培养条件变化、共培养和表观遗传修饰剂代表了OSMAC方法在ELF研究中强大但未充分利用的扩展。它们的应用为释放未开发的代谢多样性提供了一条有前途的途径，同时促进了我们对ELF生态学的理解。

3. Leveraging advancements in metabolomics

由于培养条件的扰动而解锁沉默的BGC导致代谢多样化，因此需要全面的化学检测和分析。代谢组学用于深入研究特定生物系统的小分子（<1500 Da）。作为“组学”家族的一部分，它补充了基因组学、转录组学和蛋白质组学，为天然产物、疾病生物标志物、环境科学等提供了见解。在天然产物药物发现中，基因组学旨在注释编码代谢物生物合成的BGC。另一方面，代谢组学提供了生物体产生的化合物的直接检测和实际化合物。

代谢组学已经找到了研究ELF化学多样性的方法。迄今为止，只有六篇已发表的报告实施了各种代谢组学工具用于ELF天然产物研究，总结在表1中。图3显示了通过这些研究注释或分离的ELF代谢物。

3.1. Metabolomics approaches

根据研究目的，代谢组学有两种通用方法。第一种称为靶向代谢组学，其中分析并量化特定的化合物或一组化合物。另一方面，非靶向代谢组学方法能够对样品中的小分子进行全局分析。前者是假设驱动的，而后者是假设生成的。在天然产物研究中，非靶向方法最常用于发现新的或具有生物活性的代谢物。实际上，表1中列出的所有研究都使用了非靶向代谢组学。例如，Paguirigan等人（2024）；Santiago等人（2021）；Toure等人（2022）；Weerasinghe等人（2021）应用代谢组学来分析ELF物种并鉴定与观察到的生物活性相关的代谢物，而Kim等人（2023）；Luo等人（2022）用它来指导新化合物的纯化。

3.2. Trends in metabolite extraction

代谢物提取是代谢组学工作流程的第一步。在ELF研究中（表1），乙酸乙酯是最常用的溶剂，反映了其在真菌内生菌和ELF研究中的广泛使用。然而，根据目标代谢物的极性，可以使用其他有机溶剂，如二氯甲烷、甲醇、水等。尽管如此，应注意一些代谢物可能保留在菌丝体中，而另一些则排泄到发酵液中。一些小组分别提取它们，并使用代谢组学观察到代谢物谱的差异。

3.3. Trends in metabolomics data acquisition

提取后，使用质谱（MS）或核磁共振波谱（NMR）获取代谢组学数据，每种技术都有其特定的优势和局限性，在早期的综述论文中已有论述。表1中列出的所有ELF研究都采用了基于MS的方法，这可能是因为与NMR相比，MS具有更高的灵敏度和更宽的动态范围。MS可以在单个提取物中检测到数千种代谢物，但这种复杂性通常需要事先分离。因此，联用技术如LC-MS、GC-MS或CE-MS被广泛使用，其中LC-MS应用于表1中的所有研究。

虽然LC-MS促进了广泛的代谢物范围，但GC-MS通过分析气相中的化合物提供了更好的分离和减少的基质效应，并避免了离子抑制。然而，GC-MS仅限于挥发性、低分子量化合物（～50–600 Da），并且通常需要化学衍生化。相比之下，LC-MS可以分析更大且完整的分子。串联MS/MS通过将母离子碎片化为子结构以进行可靠的数据库匹配，进一步改善了代谢物鉴定，使LC-MS/MS成为强大的去重复工具。

尽管灵敏度不如MS，但NMR在代谢组学中仍然很有价值，因为它具有重现性好、样品制备最少、非破坏性、快速采集和定量精确的特点。虽然NMR对于在复杂的粗提物中鉴定单个代谢物不切实际，但它非常适合分析代谢物类别，无论是初级（糖、氨基酸、脂质）还是次级（类黄酮、生物碱、萜烯）。例如，萜烯的特征信号能够与来自真菌内生菌Colletotrichum sp.的粗提物的高抗炎活性相关联。在另一份报告中，通过基于NMR的代谢组学方法区分了药用灵芝Ganoderma lucidium的地理来源。因此，NMR也可以很容易地应用于探索ELF代谢组。

总之，基于MS的代谢组学由于其灵敏度和广泛覆盖范围仍然是ELF研究中的首选平台。然而，未来的研究也应考虑利用NMR来带来ELF代谢物多样性全面分析的另一个层面。整合NMR和MS数据集也是可能的。例如，NMR和LCMS数据的串联增强了马来西亚和新西兰蜂蜜样品之间的区分，与使用单一分析技术相比， resulting to a more comprehensive characterization of the metabolomic profiles of the honey samples。类似地，数据融合提高了不同榄仁树Terminalia catappa提取物代谢组学数据的准确性和可解释性，使得可以 confidently link the plant’s chemical shifts in response to environmental and seasonal factors。因此，未来的ELF研究应通过数据融合，整合MS和NMR数据集，来利用这些分析平台的互补性，以扩大代谢组覆盖范围，改进结构注释，并提供对ELF化学多样性的更全面理解。

3.4. Trends in metabolomics data analysis

一旦获得代谢组学数据，挑战在于从通常复杂的代谢组学数据集中提取有意义的生物学见解。统计模型和化学计量学工具对于模式识别、特征选择和代谢物注释至关重要。单变量和多变量方法都被采用，后者——如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交PLS-DA（OPLS-DA）——对于揭示高维代谢组学数据中隐藏的关系特别有用。

在表1所列的ELF研究中，PCA揭示了地衣宿主与其相关ELF之间清晰的化学区别，以及在不同培养基中生长的ELF属之间的区别。监督方法如PLS-DA和OPLS-DA通过将代谢物特征与生物活性相关联来改进这些区分，正如Santiago等人（2021）的研究所示。具体来说，源自OPLS-DA模型的S图用于确定生物活性提取物中的 discriminatory metabolite methyl xylariate (30)。互补的可视化工具，包括在MetaboAnalyst中生成的热图，进一步说明了ELF和宿主提取物之间代谢组范围的差异。

代谢物注释——通常称为去重复——通过优先考虑化学新颖的提取物来防止重新分离已知化合物。这通常是通过将精确质量（误差容限<5 ppm）与数据库（如Dictionary of Natural Products?、MarinLit和Natural Products Atlas）进行匹配来实现的。串联MS/MS通过利用碎片模式增强结构解析，并得到诸如SIRIUS、MetFrag和BUDDY等计算机工具的支持。

通过GNPS和相关平台实现的分子网络已成为去重复的强大扩展，通过将代谢物聚类成结构家族。在ELF研究中，这种方法优先考虑了用于生物活性引导分离的提取物，导致了新化合物的发现，如氧化脂肪酸（31）、xylaroamide A (32) 和六种萘酚四聚体（33-38），以及已知生物活性环二肽和chaetoglobosins的注释。

4. Extending the toolbox: Genomics, transcriptomics, and proteomics in ELF research

虽然代谢组学提供了ELF产生的化学多样性的直接快照，但它对次级代谢物生物合成潜在遗传潜力的洞察有限。基因组学通过揭示生物体中存在的BGC的完整库来填补这一空白，包括那些在标准培养条件下保持沉默的BGC。广泛使用的平台如antiSMASH和SMURF能够快速预测和分类BGC，而更高级的框架如BiG-SCAPE和CORASON则促进BGC相似性网络和系统发育分析。这些软件工具只是可用于表征BGC的广泛计算算法中的一部分。

应用尖端基因组策略已经在细菌（如链霉菌）和植物相关真菌内生菌中证明了其变革性，通过加速新天然产物的发现。相比之下，ELF基因组学仍处于起步阶段，迄今为止仅有两个已发表的例子：来自Usnea longissima的Dothichiza sp.的基因组草图，其中未进行BGC注释，以及最近测序的Anthostomella pinea，其揭示了91个功能性BGC和600多个工业相关的碳水化合物活性酶。这些有限的报告突出了ELF巨大的、但很大程度上未开发的生物合成潜力，强调了在这一真菌类群中进行更系统基因组探索的必要性。

尽管BGC注释揭示了它们的生物合成潜力，但许多BGC在正常培养条件下仍然保持沉默或失活。转录组学是另一种强大的组学技术，可以阐明哪些BGC被主动表达。当与OSMAC策略结合时，转录组学可以阐明调控次级代谢物生物合成的分子机制。例如，用DNMT抑制剂5-氮杂胞苷处理显著增加了Aspergillus clavatus中细胞松弛素E、展青霉素和假乌拉坦A的产量，转录组数据证实了相应BGC的上调。类似地，将Streptomyces coelicolor与粘细菌菌株Corallococcus coralloides B035共培养诱导了与抗菌化合物十一烷基灵菌红素生产相关的基因表达。然后，转录组学通过识别差异表达基因和调控网络，并为更强大和高效的宿主生物进行工程改造，为合成生物学研究奠定了基础。

转录组学也被应用于探索地衣共生体内的生态相互作用。例如，与活性氧清除、蛋白质保护和DNA修复相关的应激相关基因的转录组谱在UV-B暴露下由Lobaria pulmonaria的mycobiont伙伴特别表达。同样，在干旱条件下，与L. pulmonaria相关的细菌中应激适应基因和特殊的酮代谢被上调。将此类方法扩展到ELF可以为了解它们在地衣全息组内的功能作用提供有价值的见解，这一领域至今仍 largely unexplored。

与基因组学和转录组学一起，蛋白质组学提供了另一种阐明表达的BGC与产生的代谢物之间联系的方法。通过比较不同生长条件下的蛋白质表达谱，蛋白质组学分析可以揭示途径调控的转变，并 pinpoint 驱动次级代谢物产生的关键酶或调控蛋白。最近应用“蛋白质优先”策略的工作证明了其在检测芽孢杆菌和链霉菌中的大酶方面的力量， uncovering expressed hybrid clusters such as the zwittermicin?A enzyme system and even entirely new lipopeptide pathways, thereby expanding the catalog of functionally active BGCs beyond what genome mining alone can reveal。因此，在ELF生物勘探中使用蛋白质组学工作流程可以直接检测关键表达的酶，并且当与代谢组学分析配对时，可以加速ELF次级代谢途径的功能表征。

5. Future perspectives: Multi-omics and AI integration

组学技术已成为天然产物发现持续转型中的强大平台。转录组学和蛋白质组学分析将基因组和代谢组数据联系起来，从而实现对生物合成代谢的系统级整体理解。代谢物可以根据生化途径进行集体解释。在途径分析中，代谢物被映射到已知或策划的生化反应中，从而揭示它们在生物系统背景下的功能。公开可用的数据库如KEGG和BioCyc通常用于注释代谢途径。识别此类途径可以与各种生物学条件相关联，因此可以整合到其他组学技术中。许多在线工具已被建立用于将代谢组学数据映射到生化途径中，例如在MetaboAnalyst、PaintOmics、meltDB 2.0和3Omics中，并可以选择与基因组学或转录组学数据整合。虽然尚未应用于ELF研究，但这种整合可以在系统生物学框架内揭示全面的理解。

因此，整合这些最先进的技术代表了天然产物生物勘探的新兴趋势。计算平台如NPLinker（支持基因组-代谢组关联）和SeMa-Trap（整合转录组学和代谢组学以识别用于异源表达或基因工程的BGC靶标） exemplifies the growing suite of integrative bioinformatic tools developed for natural products discovery。最近的一篇综述提出了三种策略方法，以指导研究人员为特定研究目标选择最合适的组学技术。

并行地，机器学习（ML）和人工智能（AI）的进步通过简化基因组和代谢组挖掘、结构解析以及化合物生物活性和分子靶标的预测，进一步加速了药物发现。机器学习（ML）算法如DeepBGC和BGC-Prophet可以 unravel novel BGCs that may encode new natural products。在代谢组学中，监督ML模型如遗传算法、随机森林、支持向量机和人工神经网络有效地贡献于关键的数据处理步骤，如峰识别、归一化和缺失数据插补，以及下游分析，如生物标志物发现、分类和途径映射。基于NMR数据的结构解析可以通过开发的模型如SMART-Miner和TransPeakNet得到增强。最近的计算平台如CTAPred和D3Carp进一步扩展了AI的实用性，通过预测天然产物的蛋白质靶标，而毒性模型如ToxCast可以 anticipate potential toxicity of compounds。总之，这些AI和ML enabled tools among other examples are transforming natural products research from data-intensive workflows into predictive, hypothesis-driven pipelines, with clear potential to revolutionize natural products including ELF bioprospecting。

总而言之，整合组学与AI相结合应构成未来ELF天然产物生物勘探的基石。我们设想一个研究轨迹，其中ELF发现流程结合了OSMAC策略、多组学整合和AI驱动的分析。这种系统级框架不仅将从未开发的ELF中扩展化学多样性，而且还将提供对其在地衣内生态作用的机制性见解。随着该领域向前发展，此类跨学科创新对于实现ELF的全部生物技术潜力至关重要。

6. Conclusions

ELF仍然是结构多样且具有生物活性的天然产物的未充分探索的储存库。当前的ELF研究主要集中在OSMAC方法内的培养基变化，但替代方法——如共培养系统和添加表观遗传修饰剂——对于激活沉默的BGC具有强大的前景。重要的是，ELF在地衣共生中的生态作用仍然研究不足，通过共培养重建自然相互作用可以阐明代谢物多样性和功能动态。代谢组学已证明在菌株优先排序和新代谢物发现方面是有效的，然而与互补组学方法（特别是基因组学和转录组学）的整合在ELF研究中仍然有限。新兴的生物信息学平台， together with ML and AI, offer transformative opportunities to link BGCs with metabolites, predict bioactivity, and streamline dereplication。展望未来，一个整合了OSMAC、代谢组学、多组学和AI的系统级框架不仅对于推进ELF生物勘探至关重要，而且对于深化我们对其生态意义的理解也至关重要。