综述：然而，它们持续存在：解决与食物相关的单核细胞增生李斯特菌研究中持久性僵局的问题

《Critical Reviews in Microbiology》：Nevertheless, they persist: addressing the stalemate of persistence in food-associated Listeria monocytogenes research

本综述系统探讨了单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）在食品加工环境（FPEs）中的持久性机制这一研究瓶颈。文章批判性评估了全基因组测序（WGS）应用近十年来的研究成果，指出当前领域因定义模糊（如SNP阈值争议）和方法学偏差（如富集培养的选择性）而陷入僵局。作者强调需整合生态学（如生物膜、微生物互作）、进化生物学（如水平基因转移HGT）和预测模型（如EnABLe）的多学科视角，并倡导建立结合高质量元数据和表型数据的标准化框架，以推动食品安全风险评估和管理策略的创新。

　　

2. 持久性的概念：重要性及挑战

2.1 研究现状：持久性谱系及相关特征的模式

全基因组测序（WGS）技术革新了单核细胞增生李斯特菌的流行病学研究和溯源工作。通过对2015-2024年间47项研究的综合分析，发现CC9、CC121和CC321等克隆复合体（CCs）更常与持久性菌株相关，而谱系II分离株的持久性发生率高于谱系I。基因层面研究虽揭示了与消毒剂耐受（如qacH、bcrABC）、重金属抗性（如cadA、arsCBADR）及应激生存（如SSI-1、SSI-2）相关的遗传元件，但这些关联缺乏一致性。表型研究同样表明持久性菌株对环境应激源（温度、pH、盐度）的耐受性和生物膜形成能力增强，但均无法完全解释持久性现象。

2.2 定义模糊性及其对持久性研究的影响

“持久性”缺乏统一操作定义，不同研究在采样频率（每周两次至季节性）、分型方法（PFGE、MLST、WGS）和判定阈值（如SNP差异≤20-25）上存在显著差异。近期研究质疑SNP阈值的适用性，强调需结合核心基因组MLST（cgMLST）和详细元数据（采样位置、时间跨度、清洁状态）进行综合判定。标准化框架的缺失限制了菌株间比较和机制解析，凸显了学术界、政府与产业界协同制定共识标准的迫切性。

3. 方法学挑战与偏差

3.1 分型方法对持久性认知的影响

从血清分型、PFGE到7基因位点MLST，再到WGS技术，分型分辨率的提升增强了菌株区分能力。WGS已成为流行病学调查的“金标准”，其不仅能提供高分辨率分型，还可揭示基因组结构和基因内容差异，这对识别高风险序列类型（STs）和制定靶向防控策略至关重要。

3.2 富集培养与菌落选择对持久性认知的偏差

基于标准规程（如USDA、ISO）的富集培养（使用BLEB、Fraser等培养基）和选择性琼脂（如ALOA、PALCAM）可能引入选择偏好，例如CC87在亚洲常见但因Fraser培养基生长受限而在欧洲低估。单一样本中多菌株共存现象（11.7%食物样本）和有限菌落挑选数量（1-5个）进一步扭曲了对菌株多样性和遗传特征的认知。

3.3 改进检测和持久性分类的互补方法

宏基因组学（quasi-metagenomics）对富集馏分进行测序可规避分离步骤，减少培养偏差，但需高测序深度和成本。长读长测序（如Oxford Nanopore）提升了基因组质量和李斯特菌序列识别能力。RT-qPCR结合活性染色（如CFDA/PMA）有望实现更快速检测和存活状态评估，但这些方法仍需与分离培养相结合以满足溯源需求。

4. 理解持久性的整体性途径

4.1 生态学视角：定义单核细胞增生李斯特菌的生态位

持久性可能由环境背景（非生物因素）驱动。研究指出碳、氮、pH等参数与环境中李斯特菌分布相关，呼吁收集详细元数据（pH、风速、消毒剂类型、表面材料）以界定其生态位。环境测量数据（温湿度、光照）的整合有助于解析物理化学特性对菌株生存的影响。

4.2 代谢活性与持久细胞形成

单核细胞增生李斯特菌在FPEs中经历从活跃生长到亚致死损伤、休眠（VBNC状态）及持久细胞形成的生理状态连续谱。持久细胞可在应激解除后快速恢复活性，而消毒剂暴露、营养限制和渗透胁迫可诱导其形成。研究表明高盐度持久性可提供交叉保护对抗热应激，但遗传特征（如应激耐受基因）与持久性表型的关联仍不明确，且缺乏对FPE分离株持久细胞形成的深入研究。

4.3 群落背景：共现微生物群与种间互作

16S rRNA测序揭示韦荣球菌属（Veillonella）、假单胞菌属（Pseudomonas）与李斯特菌正相关，而乳酸菌（如肠球菌）通过产酸或细菌素抑制其生长。真菌和原生生物的作用尚不清楚。扩增子测序缺乏物种分辨率，需结合培养互作实验探究定殖和生存机制。

4.4 生物膜与持久性

生物膜作为物理庇护所，可通过多物种协作增强对消毒剂的抗性。研究显示单核细胞增生李斯特菌可整合入三物种生物膜而不改变群落转录活性，且多样性高的生物膜降低其对清洁措施的敏感性。生物膜还是基因交换热点（如通过HGT获取新适应性），但动态环境波动（温度、pH、营养）的影响需进一步研究。

4.5 进化过程与适应：基因组可塑性及遗传新颖性

谱系II菌株较谱系I更频繁发生重组，可能解释其更高持久性。比较基因组学显示土壤和FPE分离株的核心/附属基因存在差异，表明环境特异性适应。移动遗传元件（MGEs）（如原噬菌体、转座子）在持久性克隆中更常见，而非持久性菌株富含限制MGE整合的系统（如CRISPR-cas IIA）。质粒携带率在不同ST间差异显著（14.4%-54%），其与持久性的关联仍需深入解析。

5. 将持久性整合至预测模型

预测微生物学模型（如ComBase）聚焦食基质中的生存，而基于机器学习算法可分析温度、pH、水分等对生长的影响。基因组尺度工具（Listeriomics、ListPred）支持基因表达和消毒剂敏感性预测，但未区分持久性菌株。智能体建模（如EnABLe）模拟FPEs内污染传播，但尚未纳入持久性参数。EFSA提出的风险评估模型迭代版本整合了毒力、应激耐受性和菌株特异性特征，表明持久性菌株比高毒力或高密度种群风险更大，凸显了将持久性参数化纳入风险评估框架的必要性。

6. 结论

单核细胞增生李斯特菌的持久性是多因素现象，受微生物生态、环境背景和进化过程共同塑造。突破当前研究僵局需整合WGS高分辨率分型、功能实验和高质量元数据，建立标准化持久性定义。通过融合生态进化视角和预测模型，有望开发针对性监测和管理策略，最终构建更安全的食品体系。