槲皮素药物疗法缓解食物色素共暴露所致小鼠胆碱能/GABA能神经递质改变及行为缺陷

本研究发现槲皮素（Que）通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、提升谷氨酸脱羧酶（GAD）表达、减轻氧化应激（降低MDA、NO水平，提升GSH、SOD、CAT活性）及神经炎症（降低TNF-α、IL-6），有效改善食物色素（Erythrosine与Tartrazine，ET）共暴露引起的小鼠行为异常及神经生物学损伤，为防治合成色素神经毒性提供了天然药物干预策略。

　　

背景

食品色素对食物偏好和食欲价值具有显著影响，其应用范围从家庭烹饪到商业食品生产。然而，市售食品和饮料中可能含有过量使用的人工合成色素甚至非法色素，这可能导致多种健康问题，包括多动症、过敏反应、癌症、荨麻疹、鼻炎和哮喘等，严重影响生活质量。食品工业广泛使用人工食用色素（AFC），因其可用性、经济性、稳定性和盈利性。研究表明，AFC具有遗传毒性、致癌性和神经毒性。在人类和动物中，AFC据报道与行为障碍相关，并引起神经精神症状和新生儿致畸性，这些可能通过增加活性氧（ROS）产生、激活小胶质细胞炎症因子释放、降低线粒体复合物I和II活性、改变神经递质合成和摄取等机制发生。

赤藓红（Erythrosine）和柠檬黄（Tartrazine）（ET）是众所周知的合成食品色素，用于食品、纺织品、药品、化妆品和医药中，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，其每日可接受摄入量（ADI）分别为0–7.5 mg/kg和0–0.1 mg/kg体重/天。ET暴露与遗传毒性、致突变性、胃肠道毒性、生殖毒性、肝毒性、神经毒性、肾毒性、γ-氨基丁酸（GABA）、去甲肾上腺素、血清素和多巴胺抑制、染色体畸变和细胞毒性效应有关。

另一方面，药物治疗方法在治疗神经退行性疾病及其相关症状方面正获得全球关注。有趣的是，植物来源的化合物，即营养保健品，由于其低成本和可用性，现已被认为是几种精神疾病和神经退行性疾病的靶向治疗和维持选择。有复合证据表明，使用植物可能是有效减轻神经退行性疾病负担的重点。在用于治疗神经退行性疾病的植物中发现的外源性抗氧化剂中，维生素C（Vit. C）是一种强大的抗氧化剂，显著有助于预防或减轻神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病。它有助于保护脑细胞免受氧化损伤，这是这些情况下的关键因素，并可能影响有害蛋白质聚集体的发展。尽管研究仍在进行中，但通常建议通过食物或补充剂维持足够的Vit. C水平以实现最佳脑功能。与用于治疗神经退行性疾病的其他合成药物相比，Vit. C似乎更安全、危害更小且价格合理。

槲皮素（Quercetin），结构上称为（2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-4-H-色烯-4-酮），是一种营养保健类生物黄酮，来源于植物，存在于蔬菜、水果和饮料中。它以其药理学益处而闻名，文献中广泛记载，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗糖尿病和抗高血压活性。槲皮素的神经保护作用与其减轻氧化应激和上调高脂饮食（HFD）中海马PI3k、AKT、核转录因子2（Nrf2）、CREB和BDNF表达的能力有关。据报道，槲皮素在体内和体外模型中通过减少氧化应激、梗死体积、脑肿胀、细胞损伤和改善行为功能，在缺氧和缺血中发挥神经保护作用。据报道，它还能抑制铝诱导的细胞色素c（cyt-c）易位，下调Bcl2相关X蛋白（Bax）、肿瘤蛋白p53、caspase-3激活，减少DNA fragmentation并上调B细胞淋巴瘤2蛋白（Bcl-2）水平。据报道，槲皮素通过下调凋亡和自噬途径，逆转铜、6-羟基多巴胺和鱼藤酮介导的SH-SY5Y细胞神经毒性。

尽管有大量论文报道槲皮素的神经保护作用，但槲皮素在食物色素诱导的神经毒性中的神经源性特性及其可能的作用机制普遍缺乏。因此，我们的研究评估了槲皮素对暴露于食物色素中毒的小鼠相关脑区（前额叶、海马和纹状体）的神经行为功能、神经炎症、神经化学代谢酶活性和组织病理学变化的影响。本研究为解决食物色素暴露的神经毒性效应提供了理论基础，鉴于其普遍使用且无法消除食品中色素的诸多益处。

材料与方法

药物与试剂

赤藓红（E127; 95%, 1159360025）、柠檬黄（E102; T0388-100 G）、槲皮素（纯度≥95%）和维生素C购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯），除非另有说明。本研究中使用的所有试剂和化学品均为最高质量和分析级。

动物采购与伦理声明

所有实验测试和程序均经机构动物伦理委员会（PUMS-AREC/App/04/012/14）批准，该委员会符合NIH出版物第25卷第28号（1996年修订）的规定。十周龄雄性瑞士小鼠（25–28 g）购自PAMO医学科学大学动物实验室，实验动物在大学动物饲养设施的标准实验室条件下维持。

实验设计

将实验动物分为五组（n=8），并通过功效分析确定本研究的最小样本量；对照组（给予蒸馏水；10 mL/kg，口服）、赤藓红和柠檬黄（ET；10 mg/kg，1:1，口服）、槲皮素（(Q)；5和10 mg/kg，口服）和维生素C（Vit. C；100 mg/kg，口服）。槲皮素和Vit. C组每天与新鲜配制的ET蒸馏水溶液共同处理，而治疗药物（槲皮素和Vit. C）每天溶解在蒸馏水中，并在ET处理后30分钟口服给药。所有处理持续4周直至终止。ET、槲皮素和Vit. C的剂量选择基于我们初步研究并稍作修改（示意图表示）。

行为测试

小鼠在Que和ET治疗第27天和第28天后1小时进行行为测试，以使用旷场 apparatus（OFT）、明暗转换测试（LDT）和悬尾测试（TST）分别确定运动表现和焦虑抑郁样行为。

旷场测试

使用旷场范式（35×30×23 cm），分为3个同心区，用于确定小鼠在第27天处理后适应行为测试室1小时后的运动和探索行为，以避免任何环境应激的结果。测试期间，每只实验小鼠被放置在带有摄像机的旷场空间中心，允许自由探索5分钟。记录四只爪子完全越过的线数，作为自发运动的指标，而站立（后肢站立，前爪离地）和理毛（头尾和舔爪行为）活动被记录并用作衡量实验小鼠焦虑和抑郁样行为的指标。测试由两名对实验不知情的训练观察者监测和记录。用70%乙醇清除先前测试小鼠的嗅觉线索。

明暗转换测试

第27天进行LDT，使用两节式木制明暗装置（21×42×25 cm），有一个3 cm×5 cm的有限开口，评估小鼠的焦虑样行为。每只实验小鼠被放置在明室，允许自由探索LDT装置五分钟，由两名不了解治疗条件或实验设计的训练人员监测。记录在LDT装置明区和暗区停留的时间，作为评估槲皮素或Vit. C抗焦虑作用的指标。每只动物测试后，使用70%乙醇消除嗅觉线索。

悬尾测试

第28天对每只小鼠进行悬尾范式，以评估槲皮素的抗抑郁样行为。简言之，每只小鼠的尾尖用胶带悬吊，离地50 cm，持续6分钟。记录每只经槲皮素或Vit. C处理的动物在悬尾装置上适应前2分钟后4分钟内的不动时间（冻结行为）。当每只小鼠保持被动和完全不动时，被视为衡量抑郁样行为水平的指标，并在实验小鼠活动延长时衡量槲皮素或Vit. C的抗抑郁效果。测试由两名对实验不知情的训练观察者监测和记录。

生化与组织学分析

行为测试后24小时（第28天），从禁食过夜的小鼠采集血液，使用Accu-Chek血糖仪从尾静脉测定空腹血糖（FBG）。五只小鼠使用盐酸氯胺酮麻醉，然后通过颈椎脱位处死。用于生化分析时，采集脑组织并在冰上切片以分离感兴趣区域（前额皮质、海马和纹状体）。分离的区域进行匀浆并在4°C下以10,000 r/min离心10分钟以获得上清液。上清液储存于-20°C直至进一步分析。此外，每组三只小鼠通过心脏穿刺用PBS和缓冲甲醛（10%）灌注，上述脑相关区域进行处理并移除用于组织结构评估。

氧化应激、髓过氧化物酶和神经化学酶活性评估

通过分光光度法评估前额皮质、海马和纹状体上清液中的促氧化剂、内源性抗氧化剂、髓过氧化物酶和乙酰胆碱酯酶活性。蛋白质浓度测定根据双缩脲法进行。测量促氧化剂水平，包括丙二醛（MDA）水平（用于脂质过氧化活性，如前所述）和亚硝酸盐水平（如建立的方法）。测定还原型谷胱甘肽（GSH）浓度、超氧化物歧化酶（SOD）活性（如所述）和使用钼酸铵和过氧化氢作为酶底物的过氧化氢酶（CAT）活性（如所述）。分别评估乙酰胆碱酯酶（AChE）和谷氨酸脱羧酶（GAD）水平。

促炎介质评估

使用ELISA试剂盒，根据制造商描述的程序测定上述脑感兴趣区域上清液中的促炎介质，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。所有读数均使用96孔ELISA微孔板读数器记录。

组织病理学和组织形态计量学检查

将收获的灌注小鼠脑固定在10%多聚甲醛中，脱水，石蜡包埋，并使用切片机切片（5 μm）。将安装在载玻片上的脑组织切片用苏木精和伊红（H&E）溶液染色，以进一步检查形态学变化。使用Olympus复合显微镜（美国）和可拆卸的AmScope MD500相机（美国）获取染色脑切片的数字图像。

统计分析

使用Graph Pad Prism 8.4.3（GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）统计软件和Image-J软件（美国NIH）进行统计分析和图像处理。采用单因素和双因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey事后检验来比较实验组。所有获得的值均以平均值±标准误（S.E.M.）表示，并在p<0.05时认为显著。

结果

槲皮素对赤藓红和柠檬黄扰乱的体重和空腹血糖水平的影响

与对照组相比，连续ET处理显著（p<0.05）降低了体重，从治疗第一周持续到最后一周，而脑重未观察到显著差异。与对照组相比，口服ET共暴露的小鼠观察到显著更高的FBG水平。然而，槲皮素（10 mg/kg）治疗显著（p<0.05）减轻了ET共暴露小鼠FBG水平的升高。

槲皮素治疗预防赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠行为缺陷

ET共暴露加剧了自发运动活动（多动行为），表现为旷场测试中穿越线次数显著增加，以及焦虑和抑郁样活动（站立和理毛行为）显著增加。此外，在LDB测试中，ET共暴露通过增加在暗室停留的时间相对于明室的时间来诱导焦虑和抑郁样行为，并且在TST中增加不动时间，与对照组相比。另一方面，槲皮素（5和10 mg/kg）治疗，类似于Vit. C治疗，逆转了ET共暴露小鼠观察到的多动行为、焦虑和抑郁相关活动。

槲皮素治疗抑制赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠脑内乙酰胆碱酯酶增加

ET共暴露升高了前额皮质、海马和纹状体中AChE酶的水平，与对照组相比。相反，槲皮素（5和10 mg/kg）治疗显著降低了上述脑区的AChE水平，与ET共暴露小鼠相比。尽管Vit. C治疗显著降低了纹状体AChE水平，与ET共暴露小鼠相比。

槲皮素治疗提升暴露于赤藓红和柠檬黄共暴露的小鼠脑内谷氨酸脱羧酶水平

ET共暴露降低了前额皮质、海马和纹状体中GAD水平，与对照组相比。相反，所选剂量的槲皮素（5和10 mg/kg）显著增加了脑区的GAD水平，与ET共暴露小鼠相比。此外，Vit. C治疗增加了海马和纹状体GAD水平。

槲皮素治疗挽救赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠脑内氧化应激

ET共暴露显著增加了海马和纹状体MDA水平以及皮质和纹状体亚硝酸盐水平，同时海马亚硝酸盐水平降低，与对照组相比。然而，槲皮素治疗以剂量依赖效应显著降低了升高的海马和纹状体MDA水平以及皮质和纹状体亚硝酸盐水平，但增加了海马亚硝酸盐水平，与ET共暴露小鼠相比。Vit. C治疗在不同脑区调节MDA和亚硝酸盐水平，类似于槲皮素治疗。

槲皮素治疗提升暴露于赤藓红和柠檬黄共暴露的小鼠脑内内源性抗氧化酶活性

ET中毒共暴露的小鼠显示海马和纹状体GSH水平、皮质和海马CAT水平以及海马SOD水平显著降低，与对照组相比。同时，槲皮素治疗以剂量依赖（5和10 mg/kg）和区域特异性效应显著增加了海马和纹状体GSH水平、皮质和海马CAT水平以及海马SOD水平，与ET共暴露小鼠相比。

槲皮素治疗预防赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠脑内促炎细胞因子增加

与对照组相比，皮质、海马和纹状体TNF-α水平以及皮质、海马和纹状体IL-6水平在ET中毒共暴露后显著升高。槲皮素治疗以剂量相关方式（5和10 mg/kg）和区域特异性效应，类似于Vit. C治疗，显著降低了ET共暴露小鼠升高的TNF-α和IL-6水平。

槲皮素治疗减轻赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠脑内CA1和CA3海马亚区神经退行性变

ET共暴露导致海马CA1和CA3亚区神经元改变增加，表现为神经元团块和坏死，与对照组相比。然而，槲皮素治疗（5和10 mg/kg），类似于Vit. C治疗，显著抑制了海马CA1和CA3亚区锥体神经元的丢失，与ET共暴露小鼠相比。

槲皮素治疗减轻赤藓红和柠檬黄诱导的小鼠脑内皮质和纹状体神经退行性变

ET共暴露的小鼠表现出皮质和纹状体神经元的显著丢失，与对照组相比。然而，槲皮素治疗（5和10 mg/kg）类似于Vit. C治疗，显著抑制了皮质和纹状体神经元的丢失，与ET共暴露小鼠相比。

讨论

食品色素的神经毒性、神经精神和致畸后果在文献中有充分记载。然而，食物色素神经毒性效应的机制与氧化应激、炎症和细胞凋亡有关。本研究调查了槲皮素对食物色素诱导的小鼠行为缺陷和神经生物学改变的药物治疗相关性。通过行为测试、氧化应激标志物、神经炎症介质、神经递质代谢酶水平和组织病理学变化，我们确认槲皮素类似于Vit. C治疗，预防了行为缺陷，并减轻了氧化和炎症信号级联、神经化学改变和实验小鼠共暴露于食物色素（赤藓红和柠檬黄；ET）的神经形态学变化。此外，我们的发现与我们实验室获得的初步数据和现有文献一致，表明持续共暴露于食物色素后，小鼠出现高血糖、体重变化、运动障碍、焦虑和抑郁样相关行为、AChE升高以及氧化剂和神经炎症增加。

高血糖是代谢功能障碍的一线临床表现，与 developing 其他相关并发症有关。已知食物色素诱导的高血糖会对身体器官造成长期损伤、破坏和功能衰竭。一些文献证明，长时间和不受控制的暴露于应激事件会触发HPA轴激活，以增加血糖水平以及大量分泌皮质酮。值得注意的是，槲皮素的降血糖作用与调节参与葡萄糖代谢的酶、改善葡萄糖耐量和胰腺β细胞功能以及增加胰岛素敏感性和释放有关。然而，从本研究获得的数据来看，槲皮素治疗虽然以剂量相关方式，但对ET共暴露后观察到的葡萄糖浓度升高产生了显著逆转作用，证实了其降血糖作用，如文献先前记载。

接下来，ET共暴露引发了显著的行为缺陷，表现为运动行为和探索活动增加。先前的研究表明，儿童在过量摄入ET后出现多动症，啮齿类动物也有报道。当持续暴露于慢性应激源或可能引起神经化学失衡并改变神经元回路的物质时，运动和行为探索受损被认为是啮齿类动物经历的一些特征。此外，本研究的发现与先前报道暴露于食物色素后出现神经精神障碍特征的研究一致。使用LDT和TST范式，我们的研究进一步表明，单独暴露于ET的动物表现出行为绝望，表现为在LDT范式中在明室停留时间减少和在暗室停留时间增加，以及在TST中不动时间延长。这种相关的行为绝望在应激条件下有报道，表明绝望、退缩和动机丧失的迹象。有趣的是，槲皮素治疗以类似于Vit. C治疗的方式，通过减少多动行为（运动和探索活动）、焦虑和抑郁样相关活动，改善了暴露于ET中毒的动物的神经行为损伤。槲皮素和Vit. C处理的动物表现出希望和动机的迹象，从而促进缓解并抑制了ET诱导的焦虑和抑郁行为。因此，我们假设本研究中观察到的行为稳定性可能是由于该化合物能够调节动物体内的胆碱能和谷氨酸能/GABA能神经传递活动。

应激诱导的免疫系统激活据报道涉及神经递质代谢的失调，这可能影响情感行为的发病机制。同时，脑区神经回路的改变，包括前额叶、海马和纹状体，与行为绝望的发展有关。ET共暴露对神经递质代谢的影响在本研究中提高了不同脑区动物的AChE并降低了GAD水平。根据我们先前的研究，我们报道了大鼠在暴露于低、中和高剂量ET后，前额皮质、海马和纹状体中AChE水平增加。AChE是胆碱能系统代谢酶，负责将乙酰胆碱（ACh）水解为胆碱和乙酸，导致在 elevated 水平时突触中ACh减少。AChE升高与神经可塑性受损有关，这是乙酰胆碱水平降低的结果，可能导致情绪、注意力和认知受损，而低AChE与改善记忆表现有关。此外，最近的文献报道，GAD是GABA能系统功能、合成和释放的限速酶，在焦虑和抑郁中起关键作用。同时，研究将低GAD浓度与GABA表达减少和谷氨酸表达增加联系起来，这是几种神经和神经精神障碍中运动