抗草甘膦转基因玉米CC-2大鼠多代发育毒性及安全性评价研究

本刊推荐：本研究通过多代大鼠喂养试验系统评估抗草甘膦转基因玉米CC-2的食用安全性。结果表明，与常规玉米相比，CC-2玉米在妊娠结局、体重增长、行为学测试、器官指数等方面均无显著差异，虽部分血液学参数存在差异但组织病理学未见异常，且未检测到外源基因片段转移，证实CC-2玉米对大鼠生长发育具有相对安全性（GR/GE/GM）。

　　

引言

随着社会持续发展，人类面临日益严峻的挑战，包括自然资源枯竭、人口爆炸性增长、病虫害、作物病害以及传统和现代育种方法的局限性。这些挑战推动了新技术的开发，转基因（GM）作物作为重大创新应运而生，有效应对这些挑战并为全球种植者带来诸多益处。自1994年商业化以来，转基因作物因其巨大增长潜力在全球迅速推广，包括玉米、大豆、棉花、油菜、马铃薯、木瓜、苜蓿、南瓜和甜菜等多种作物。其中，抗草甘膦（GR）作物是针对草甘膦除草剂广泛使用而开发的一类基因工程产品。草甘膦除草剂特异性靶向5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），以其广谱、高效和低残留著称，成为全球使用最广泛的除草剂。

传统作物同样含有EPSPS靶点，意味着在作物生长期间施用草甘膦会不利影响作物发育同时消除杂草。基因工程使开发抗草甘膦作物成为可能，从而实现更经济有效的杂草控制。因此，GR作物迅速被农业生产者接受，成为农业史上采纳最快的转基因作物。尽管益处显著，公众对转基因作物食品安全的担忧持续存在，这些担忧可能源于三个潜在来源：插入基因及其表达蛋白、基因表达产物的次级或多效效应，以及可能对受体生物天然基因的干扰。食品安全评估通常结合三种方法：研究结构/功能关系以提示潜在毒性和致敏性、使用酶、受体蛋白或培养细胞系的体外试验，以及体内动物研究。其中，动物研究往往提供最指示性的证据，表明测试物质在人类中的潜在毒性效应。

当前评估GR作物整体食品安全的动物实验主要集中于亚慢性和慢性毒性，针对特定生理阶段毒性的研究相对较少。因此，本研究旨在基于指南和先前研究，评估GR作物作为饲料在大鼠中的相对安全性。本研究使用的作物是中国农业大学（CAU）开发的CC-2玉米。CAU的研究人员克隆了高粱叶绿体转运肽（CTP）的EPSPS基因，将其与农杆菌CP4 EPSPS基因融合，获得maroACC基因，该基因表达maroACC蛋白，赋予作物草甘膦抗性。

材料与方法

植物材料与饲料

使用抗草甘膦玉米（CC-2）作为干预，非转基因玉米（东单119，DD-119）作为对照。两种玉米均由中国农业大学提供。北京营养源研究所分析了两种玉米品种的营养成分。为确保饲料含有尽可能多的碳水化合物，基于营养分析和AIN-93G饲料配方，CC-2玉米在饲料中的补充量为85.92%。因此，设计了三种理论上蛋白质、碳水化合物和脂肪浓度相等的饮食。

动物与生物伦理

48只雌性SD大鼠（体重230–280克，妊娠第0天）由北京大学医学部实验动物科学部提供。大鼠饲养在特定病原体（SPF）动物饲养室中，室内温度24°C–26°C，相对湿度50%–60%，照明为12小时光暗循环。动物饲养、管理和实验操作均按照北京市实验动物管理条例进行。研究方案经北京大学医学部伦理委员会审查批准。

实验设计

孕鼠（亲代）随机分为三组（每组n=16），从妊娠第0天起饲喂不同饲料。三组包括空白对照组（AIN）饲喂AIN-93G；正常对照组（NM）饲喂非转基因饲料（85.92% DD-119玉米）；转基因组（GM）饲喂85.92% CC-2玉米。从妊娠第0天起，每日监测亲代大鼠，分娩后记录妊娠结局指标。后代大鼠从出生起每日监测，产后第4天（PND 4）进行窝标准化，每窝保留四只雌性和四只雄性大鼠。

大鼠在PND 21断奶。断奶后，每组随机保留八只雌性和八只雄性大鼠进行90天喂养实验（PND 21–111），饲喂与其母代相同的饲料。实验结束时，后代禁食过夜，随后在麻醉结合放血下实施安乐死，收集血液和器官。

实验指标

妊娠结局

分娩后，计数每窝活仔数、死产数、雌性和雄性仔鼠数，计算性别比（雌/雄）。记录PND 4活仔数以计算出生存活率（PND 4活仔数/活产数），记录PND 21活仔数以计算哺乳存活率（PND 21活仔数/PND 4活仔数）。

体重与摄食量

在PND 0、4、7、14和21称重仔鼠，绘制哺乳期体重变化曲线。断奶后，每周记录体重和摄食量。使用以下方程计算饲料转化率（FCR）：FCR = 摄食量/体重增益。

生长监测与测试

从PND 0起，以窝为单位每日观察，监测生理发育并测试行为发育。监测和测试时间表详见方法部分。

断奶后，大鼠在PND 21和104进行旷场试验。使用100厘米×100厘米×50厘米的黑色旷场箱，箱底用白色细胶带均匀划分为25个方格（5×5）。每次从中心放置一只大鼠，观察并记录行为180秒。

在PND 22–27和105–110进行莫里斯水迷宫测试。使用圆柱形黑色水池（直径160厘米，深度50厘米），池中水深35厘米，添加250克黑色墨水染色，水温维持在22°C。水池分为四个象限，在第二象限水面下2厘米处放置一个直径12厘米的黑色圆形平台。

每次测试持续6天：前5天进行隐藏平台训练试验，记录大鼠找到平台的时间（每天4次，每次不超过1分钟）。第6天移除平台，记录大鼠在1分钟内的探索行为。

血液学与血清生化

使用自动血液分析仪分析血常规指标，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、血小板计数（PLT）、血小板比容（PCT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、淋巴细胞计数（LYM）、单核细胞计数（MONO）、粒细胞计数（GRN）、淋巴细胞百分比（LYM%）、单核细胞百分比（MONO%）和粒细胞百分比（GRN%）。

使用自动血清生化分析仪分析血清生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、肌酐（CR）、血尿素氮（BUN）、血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

器官重量与组织病理学

大鼠处死后称重主要器官，计算器官指数。器官包括脑、心、肝、脾、胸腺、肾、肾上腺、卵巢、子宫、附睾和睾丸。

每组随机选择三只雌性和三只雄性大鼠的肝、肾、脾、子宫、卵巢、睾丸和十二指肠。上述器官用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（H&E）染色。显微镜下观察组织病理学变化。

Maroacc基因检测

从NM组和GM组随机选择三只雌性和三只雄性大鼠的脑、肝、肾、脾、子宫和睾丸。通过聚合酶链式反应（PCR）评估上述器官中maroACC基因的存在。检测外源基因和动物参考基因的PCR引物详见方法部分。

统计分析

使用Excel 2016和SPSS 23.0进行数据分析，结果以均值±标准差表示。预先进行正态性检验和方差齐性检验。对于正态分布数据，若方差齐性，使用单因素方差分析进行组间比较；否则使用Welch检验。非正态分布数据使用秩和检验。统计学显著性设定为p < .05。

结果

玉米营养成分

能量和主要营养素分析显示，CC-2和DD-119玉米在能量、蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维、水分和灰分方面无显著差异。

妊娠结局

三组间在妊娠天数、仔鼠体重、窝重、活产数、雌性和雄性仔鼠数、性别比、出生存活率和哺乳存活率方面均无显著差异。

体重

哺乳期间，所有组别体重无显著差异。断奶后，雌性大鼠体重在各组间无显著差异。然而，NM组雄性大鼠在第4、5和10周体重高于AIN组（p < .05）。体重变化如图1所示，详细数据见补充文档。第6个月时，NM组的饲料转化率高于其他两组，但差异不显著。

生长监测与测试

哺乳期生理和行为发育

生理发育监测和行为测试结果显示，组间无显著差异。

旷场试验

两次旷场试验结果如图3所示。在第一次旷场试验（PND 21）中，NM组穿越内部方格次数和站立次数高于AIN组（p < .05）。三组间其他指标无显著差异。

莫里斯水迷宫测试

如图4所示，两次莫里斯水迷宫测试中，各组在前5天的每日潜伏期或第6天的探索行为均无显著差异。

血液学与血清生化

血液学结果表明，NM组雄性大鼠的PLT、PCT和MON%值高于AIN组（p < .05），GM组雄性大鼠的MPV高于AIN组（p < .05）。其他血常规指标三组间无显著差异。

血清生化结果显示，GM组雌性大鼠的CR水平高于AIN和NM组（p < .05）。NM和GM组雄性大鼠的ALT水平高于AIN组（p < .05）。此外，GM组雄性大鼠的TP和GLU高于AIN组（p < .05）。其他指标组间无显著差异。

器官重量与组织病理学

NM和GM组雌性大鼠脑重高于AIN组（p < .05）。类似地，NM组雄性大鼠脑和睾丸重量高于AIN组（p < .05）。其他器官重量组间无显著差异。此外，三组间器官指数无显著差异。组织病理学检查显示，与两个对照组（AIN和NM）相比，GM组雌性和雄性大鼠器官未见明显不良变化。

Maroacc基因检测

图5显示，NM和GM组主要器官中均成功扩增出209 bp参考基因片段（β-肌动蛋白），而188 bp maroACC基因片段未扩增出。

讨论

如今，转基因作物的安全性引起公众广泛关注。健康风险一直是全球争议话题。研究人员进行了许多毒性研究以揭示转基因作物的相对安全性。一项GM作物MON863大鼠喂养研究的数据分析提示肝肾毒性迹象，引发了关于转基因作物使用的重大争议。在土耳其进行的另一项研究中，30只Wistar白化大鼠分为三组，分别饲喂标准大鼠颗粒饲料、含20%常规玉米的饮食或含20%Bt玉米的饮食。约40天后，血清化学和血液学值出现改变。然而，并非所有研究都得出一致结论。另一项关于Bt玉米MON 810喂养16周后对大鼠生长和健康影响的研究未检测到与营养相关的不良健康效应。因此，谨慎评估转基因作物的相对安全性至关重要。

除了体重、器官重量、血液学等传统测试外，我们还添加了旷场试验、莫里斯水迷宫评估行为、应激、空间记忆和空间导航。此外，我们对后代监测90天以评估慢性和亚慢性毒性。

对食品安全的担忧要求对转基因作物及其产品进行严格评估，作为商业释放前的若干监管要求的一部分。本研究聚焦于抗草甘膦玉米（CC-2）的相对安全性，主要有两个目标：为抗草甘膦转基因作物的安全性评估提供证据，并填补CC-2玉米发育毒性研究的空白。Zhong等人通过饲喂蛋鸡评估了CC-2玉米的发育毒性，但仅包括公鸡后代。本研究旨在补充CC-2玉米的现有安全性评估。

实质等同概念是安全评估过程的关键，用于识别新食品与其传统对应物之间的相似性和差异性。它并非安全评估，而是构建新食品安全评估的起点。证明实质等同是一个两步程序，第一步评估转基因作物的农艺、形态和化学特性，如宏量营养素。本研究中，CC-2玉米及其非转基因对应物的主要成分无显著差异，这与先前的分析一致，该分析采用整合蛋白质组学和代谢组学技术，未发现maroACC基因带来的显著非预期效应。

在众多关于转基因作物对大鼠生长发育毒性的研究中，体重和生理发育是重要的观察指标。一些研究表明，食用转基因作物可能影响大鼠体重，体重是反映发育毒性的常见指标。本研究也测量了体重。两个对照组（AIN和NM）之间存在体重差异。然而，GM组与两个对照组之间无差异，这与先前90天大鼠喂养研究结果一致。这表明饲喂CC-2玉米可能对大鼠体重无明显不利影响。我们还考虑了饲料转化率。第6个月时NM组雌雄大鼠的比率较高；然而，差异不显著。先前研究表明，宏量营养素的比例可能影响大鼠的消化吸收。例如，直链淀粉可能比支链淀粉消化更快。这在大鼠年老时尤为明显。我们确保三种饮食设计具有理论上相等的宏量营养素浓度。但我们不知道宏量营养素的结构。同时，以窝为单位监测大鼠摄食量。因此，尽管差异不显著，仍需进一步研究。此外，先前研究发现饲料营养素来源可能影响饲料物理形态。同时，饲料的物理形态和营养成分可能影响实验动物的体重。这可能解释了两个对照组之间的体重差异。

适龄发育里程碑和行为测试可以反映动物的生理和神经行为发育。我们的研究表明，GM组和两个对照组（AIN和NM）大鼠在各种发育里程碑和行为测试中表现相似，表明对大鼠早期生长发育无不利影响。

旷场试验广泛用于评估实验动物的焦虑、运动活动和探索行为。应激大鼠在开放空间中表现出较少活动和增加的主动刻板行为。站立是测试中的典型探索行为，与焦虑水平负相关。焦虑较低的动物倾向于在内部方格花费更多时间。本研究中，PND 21旷场试验中NM组雄性大鼠表现出更活跃的探索行为和更低焦虑，与AIN组相比。这种差异可能受环境和内分泌系统影响，可能需要进一步探索。GM组与对照组（AIN、NM）之间表现无显著差异，表明CC-2玉米喂养对探索和焦虑无明显不利影响。

莫里斯水迷宫是评估空间记忆和空间导航的标准测试。通常包括训练试验和探查试验。由于发育中与成熟神经系统之间的定性和定量差异，我们在断奶和成年大鼠中均进行了莫里斯水迷宫测试。两次莫里斯水迷宫测试中各组无显著差异，表明CC-2玉米喂养对大鼠空间学习和记忆无不利影响。

血液将营养素和氧气运输至细胞和组织，并将废物从细胞和组织运出；血清生化指标提供各系统和器官的具体信息，包括代谢、血液循环和液体平衡。本研究中，GM组雌性大鼠CR水平显著高于其他两个对照组，而雄性大鼠CR趋势相似但差异不显著。这一结果与一项GR作物90天大鼠喂养研究相似， except that the CR levels was statistically significant difference in male rats while female was not significantly different。由于与其测量相关的多种生理和技术问题，血清CR的解释需要谨慎。大鼠血清BUN、肾重、肾指数和组织病理学未见异常。指标差异主要存在于玉米饲料组（NM和GM）与空白对照组（AIN）之间。认为这可能与纯化饲料和玉米饲料的营养素来源有关。可使用更有针对性的测试进一步探索CC-2玉米对肾脏的影响。除CR外，两个玉米饲料组（NM和GM）之间无显著差异，表明CC-2玉米对血液学和血清生化无明显不利影响。

器官重量和指数可以反映器官的发育和健康状况，组织病理学是诊断疾病存在和性质的金标准。器官重量受体重影响很大，器官指数是更客观可靠的测量方法，校正了体重的影响。本研究发现两个玉米饲料组（NM和GM）与空白对照组（AIN）之间个别器官重量存在显著差异，但两个玉米饲料组之间器官重量无显著差异。此外，器官指数无显著差异。结合组织病理学结果，未见可归因于CC-2玉米的不良变化。

外源物质（基因和蛋白质）对于评估转基因作物食品安全至关重要。目前，很少研究评估GR作物的外源蛋白体内情况，方法的特异性仍有争议。因此，评估动物中外源基因的存在很重要。本研究中，根据CC-2插入和侧翼序列设计引物检测外源基因片段。结果显示主要器官中未扩增出目标片段，这与其他GR作物研究结果一致。外源DNA在肠液中快速降解可能导致PCR阴性结果。

局限性

本研究存在一些局限性。首先，指标差异主要存在于两个玉米饲料组（NM、GM）与空白对照组（AIN）之间。Hu的研究中也出现了类似情况。本研究和Hu等人均在饲料中添加了较高剂量的谷物。推测指标的显著差异可能与纯化饲料和谷物饲料的不同营养素来源有关。未来实验应包括不同剂量水平的实验组和对照组；谷物的详细营养含量，如维生素、矿物质、纤维和碳水化合物类型；改进加工技术；并尽可能保证饲料物理质量的一致性。其次，我们未对饲料进行PCR测试，这在未来研究中应考虑，因为它忽略了外源基因片段可能在饲料加工过程中被破坏的事实。此外，以窝为单位称重监测摄食量，样本量每组雌雄大鼠仅两个。样本量相对较小。因此，尽管NM组与其他两组之间的FCR差异不显著，进一步研究可能需考虑这一点。而且，本研究仅检测了一个外源基因片段。此外，应检测不同位点和基因片段大小，以提供动物中外源基因存在的全面评估。最后，在关键早期时间点（如PND 21）缺乏生化分析（如血清生化、ROS、炎症标志物）限制了对断奶后立即特定代谢或分子通路潜在短暂改变的检测。未来旨在全面绘制暴露后的发育进程和长期后果的研究应考虑在关键发育阶段纳入此类分析。

结论

本研究证明CC-2玉米在大鼠中相对安全。研究结果支持抗草甘膦转基因作物对生长发育的相对安全性。未来研究应解决已识别的局限性，以增强转基因作物安全性评估的稳健性和全面性。

亮点

通过饲喂孕鼠和子代大鼠评估了一种GR玉米的食品安全性。

饲料配方基于最大碳水化合物添加原则。

CC-2玉米对大鼠生长发育的安全性与其受体玉米相当。