番茄短期转录记忆与关联形成能力对超声波和干旱胁迫的响应研究

《Plant Signaling & Behavior》：Short-term transcriptional memory and association-forming ability of tomato plants in response to ultrasound and drought stress stimuli

本刊推荐：本研究通过mRNA-seq、WGBS和RT-qPCR技术，首次系统揭示番茄植株对超声波(US)和干旱(D)胁迫的短期转录记忆机制。研究发现植物能通过表观遗传修饰(DNA甲基化)维持5-10天的基因特异性转录记忆，并首次在转录水平证实植物具备关联学习能力（3/4靶基因响应）。该研究为利用植物记忆功能提升作物抗逆性提供了新策略。

　　

引言

全球气候变化导致的环境波动性加剧对农业生产稳定性和植物抗逆性产生直接影响。由于固着生长特性，植物无法逃避干旱等不利环境，因而演化出复杂的生理和分子适应机制。近年来越来越多证据表明植物具备感知、记忆和学习等认知能力，例如拟南芥能识别毛虫取食声并产生防御毒素，含羞草对重复触摸表现出习惯化反应。这种类学习现象得到" priming"（预适应）现象的支持——前期温和胁迫能使植物对后续严重胁迫产生"准备状态"，且部分响应可通过表观遗传修饰(DNA甲基化、组蛋白修饰)跨代遗传。

根据现有认知，表观遗传修饰构成植物记忆的最深层机制，而转录记忆则是其另一重要层面，表现为刺激后基因表达模式相对于初始状态的持续性改变。这种修饰转录响应由瞬时表观遗传变化(组蛋白和DNA甲基化修饰)调控，是植物记忆的表现形式。目前相关研究主要集中在模式植物拟南芥，对农业作物(如小麦、水稻、玉米等)的研究仍较为有限。

不同物种对环境胁迫的响应机制存在差异，因此需要开展物种特异性研究。超声波刺激作为一种物理处理手段，其有益生理效应逐渐被揭示。研究表明白噪声处理能显著增强拟南芥抗旱性，而超声波处理可诱导马铃薯试管苗的适应性生长响应。植物声发射技术已被用于评估植株水分传导系统受损阈值，近期研究发现番茄和烟草在干旱胁迫下会发射20-100 kHz的特异性超声波。

材料与方法

实验采用番茄(Solanum lycopersicum L. cv. Micro Tom)植株，种子播种于含MS培养基的Jiffy-7?泥炭柱，在气候室(24°C，16/8 h光周期，PPFD 89 μmol m^-2 s^-1，RH 65%)中培养三周后进行处理。

实验设置两种刺激：超声波(US)和干旱(D)胁迫，分别单独施用或组合施用。干旱胁迫通过浇灌20% PEG 6000溶液诱导，超声波处理采用30 kHz、120 W设备处理5分钟，传输介质为空气。在组合处理(US+D)中，超声处理后立即浇灌PEG溶液。实验共包含168株植物，每个初始处理组(D、US、US+D)和对照组各42株。

训练和采样程序包括五个时间点：初始处理后2天(S1)；处理后5天(S2)或10天(S3)，即在重复处理前；以及在两个实验系列中重复处理后2天(S4和S5)。通过RNA-seq、WGBS和RT-qPCR技术分析基因转录和DNA甲基化变化。

RNA测序采用Illumina NovaSeq X Plus平台进行PE150测序，使用fastp进行接头修剪，Hisat2进行序列比对，FeatureCounts进行定量，DESeq2进行差异表达基因(DEGs)分析(阈值：log2-fold change > 0.58，调整后P值 < 0.05)。全基因组亚硫酸氢盐测序使用Bismark进行比对，MethylKit鉴定差异甲基化区域(DMRs)和基因(DMGs)。通过ClusterProfiler进行GO功能富集分析。

RT-qPCR分析采用UBI作为内参基因，使用2^(-ΔΔCq)方法计算相对基因表达量，通过IBM SPSS Statistics 25进行双因素方差分析和Tukey's B检验。

结果

转录组和DNA甲基化变化

处理后2天，转录组分析显示34,075个基因中有86个(US)、410个(D)和148个(US+D)基因出现显著差异表达。功能富集分析发现D处理主要影响蔗糖代谢过程、氧化应激响应、链间交联修复等生物过程，而US+D处理主要响应创伤过程。DNA甲基化分析发现211个差异甲基化基因，其中CpG上下文占122个，CHG占86个，CHH占46个。GO分析表明D处理影响细胞微纤维组织、细胞生长等过程，US处理影响翻译、光合作用等过程，US+D处理影响最广泛的生物过程。但RNA-seq与WGBS数据间未发现直接相关性。

选择四个靶基因进行记忆研究：TIP3-2-like (TIP，干旱上调)、MYB24-like (MYB，干旱下调)、EXORDIUM-like 5 (EX，超声上调)和ARGOS (超声下调)。通过RT-qPCR验证显示mRNA-seq与RT-qPCR的LFC值皮尔逊相关系数为0.88，确认了转录组数据的可靠性。

转录记忆的形成与维持

研究发现植物对刺激的记忆以基因和刺激依赖性方式维持5-10天。MYB基因在干旱胁迫下第2天和第5天保持相同程度下调，但第10天表达强度显著不同，表明记忆维持7天，表现为Type 1(持续诱导)记忆。TIP基因在干旱胁迫下所有时间点均上调，表达强度无显著差异，表明记忆维持10天。EX基因在超声处理后所有时间点均上调，第5天表达最高，显示延迟响应和持续效应。ARGOS基因在超声处理后第2天和第5天表达强度显著不同，但第2天与第10天无差异，可能表现为Type 2(修饰再诱导)记忆。

刺激重复对记忆维持的影响研究表明，重复刺激会导致基因转录行为的各种改变，如习惯化、持续诱导或修饰再诱导。第5天重复超声处理使EX基因表达降低，而第10天重复处理使表达再次上调至第2天水平。ARGOS基因在第7天对重复超声处理表现上调，而第12天则下调。干旱胁迫下，第5天重复处理使TIP表达降低，第10天重复处理使表达显著增强。MYB基因在第5天重复干旱处理未引起额外变化，但第10天重复处理导致表达上调。

植物关联形成能力

通过组合训练(US+D处理)研究植物的关联学习能力。结果显示，在US+D训练后，第5天施用US(条件刺激)能诱导TIP上调和MYB下调，其表达强度与D处理(非条件刺激)无显著差异，表明植物能够将US作为D的预测指标。类似地，D作为条件刺激能诱导EX基因上调，其表达强度与US处理无显著差异。但在ARGOS基因中未发现关联形成证据。研究表明，3/4的靶基因在转录水平显示关联学习能力，但这种关联记忆只能维持短时间(7天)。

讨论与结论

本研究验证了四个主要假设：首先，US和D单独或组合应用2天后确实引起显著基因转录和DNA甲基化改变，但两者无直接相关性；其次，植物以基因和刺激依赖性方式记忆刺激5-10天；第三，重复应用两种刺激能增强植物转录记忆；最后，植物能够连接不同刺激，在训练后使用一个条件刺激作为另一个非条件刺激的预测指标。

全球转录组和DNA甲基化变化分析表明，两种胁迫主要影响生长和应激相关过程，这些变化具有胁迫类型特异性。DNA甲基化变化主要发生在CpG上下文，影响各种膜功能、光合作用和翻译相关过程。

转录记忆研究表明，植物能维持靶基因改变的表达水平5-10天，重复刺激会导致习惯化、Type 1或Type 2转录记忆等行为改变，这取决于基因和植株生理年龄。关联形成能力评估证实，番茄植株在组合训练后能使用一个中性刺激(CS)引发与另一刺激(UCS)相同的基因表达响应，在3/4研究的靶基因中显示关联学习能力。

本研究首次在转录水平证实植物具备关联学习能力，且训练方案相比前人研究更为简洁。研究结果为利用植物记忆功能开发可持续农业策略提供了新思路，未来需要进一步研究信号强度和时间对训练方案和关联维持时间的影响，以及组蛋白修饰和非编码RNA种群变化等其他表观遗传机制的作用。