内蒙古包头地区金黄色葡萄球菌抗生素耐药性监测及分子流行病学特征分析

本文系统研究了内蒙古包头地区金黄色葡萄球菌（S. aureus）的分布特征、耐药表型及分子流行病学机制，揭示了该地区MRSA（methicillin-resistant S. aureus）以ST59型为优势克隆株，并发现其携带多种高毒力基因（如hla、pvl等），为临床抗感染治疗和耐药菌防控提供了重要数据支持。

　　

摘要

目的

调查内蒙古包头地区金黄色葡萄球菌（S. aureus）的分布、耐药模式、多位点序列分型（MLST）及毒力基因携带情况。

方法

2018年1月至2020年12月，从参与中国抗菌药物耐药性监测系统（CARSS）的包头11家医院收集临床分离的S. aureus菌株。使用WHONET 5.6和SPSS 26.0进行数据分析。对2020年分离的90株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行MLST分型，并通过eBURST程序分析结果。随机选取2020年的90株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株与90株MRSA菌株，采用聚合酶链反应（PCR）检测20种毒力基因，包括clfa、clfb、fnbB、scn、chp、sak、coa、nuc、ebps、eno、cna和bbp等。

结果

共分离出2453株S. aureus，其中309株为MRSA。分泌物是S. aureus的主要来源（38.0%），而痰液是MRSA的主要来源（16.7%）。MRSA对大多数抗菌药物的耐药率高于MSSA。在8种已鉴定的序列类型中，ST59占主导地位（60%），主要与医院获得性手术感染相关（66.7%，36/54）。所有菌株均携带hla、hld、nuc、clfa和clfb基因，超过90%的菌株携带sak、scn和coa基因。fnbB基因在MSSA中的检出率（83%）显著高于MRSA（15%）。chp、pvl和LukED基因的检出率在不同序列类型间存在显著差异。pvl基因在ST22菌株中的检出率为67%，高于ST59、ST398和ST25菌株。

结论

包头地区S. aureus和MRSA的分离率低于全国平均水平，未发现对万古霉素、利奈唑胺或替考拉宁耐药的菌株。该地区MRSA的优势菌株为ST59型。该地区S. aureus菌株携带大量毒力基因，表明其具有高毒力。

引言

金黄色葡萄球菌（S. aureus）于1880年代由Ogston在脓液中发现，随后由Rosenbach分离。随着时间的推移，通过适应人类宿主和医疗环境，S. aureus已演变为一种重要的人类机会性病原体。它可以无症状地定植于多个身体部位，如咽部、鼻腔、腋窝和会阴部，同时也是皮肤感染、心内膜炎和菌血症的主要原因。细菌已发展出复杂的抗生素耐药机制以确保其在宿主体内的生存。S. aureus感染发生率的增加伴随着抗生素耐药菌株的流行，特别是耐甲氧西林菌株。在美国，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染比例稳步上升，现已占病例的60%至70%。MRSA感染导致的死亡人数远远超过艾滋病、结核病和病毒性肝炎的死亡总和。在大多数情况下，S. aureus通过获得耐药基因发展出抗生素耐药性。然而，MRSA菌株由于基因突变表现出固有的甲氧西林耐药性以及对常规抗生素的耐药性增加。鉴于抗生素耐药性S. aureus菌株的迅速出现以及新抗生素研发的缺乏，迫切需要替代策略来对抗耐药性S. aureus。

多位点序列分型（MLST）技术允许对七个管家基因进行测序分析以确定相应的序列类型（STs）。STs具有独特的地理分布特征；例如，ST5和ST8在美国和日本常见，而ST80在中东广泛流行。MLST与葡萄球菌染色体盒mec（SCCmec）分型结合已成为研究各种MRSA克隆全球流行病学的关键方法。S. aureus致病性的一个关键特征是产生大量毒力因子，包括分泌蛋白、酶和毒素，用于建立和维持感染。这些毒力因子使S. aureus能够逃避宿主防御并损伤宿主细胞。在传染病的临床治疗中，MRSA表现出高毒力和治疗耐药性，主要由于这些毒力因子的存在。因此，深入研究毒力因子及其致病机制对推进S. aureus感染的临床治疗具有重要潜力。

本研究分析了2018年1月至2020年12月从参与中国抗菌药物耐药性监测系统（CARSS）的内蒙古包头11家三级医院收集的S. aureus的分布和耐药模式。使用MLST调查2020年从包头医学院第一附属医院分离的所有90株MRSA菌株的流行病学特征，旨在了解该地区S. aureus的流行病学和耐药特征。此外，还检测了20种毒力基因的存在，包括scn、chp、sak、coa、nuc、ebps、eno、cna、tst和bbp，及其与毒力的关联。

材料与方法

材料

菌株

2018年1月至2020年12月期间，从包头11家CARSS成员医院收集S. aureus分离株。所有样本来自不同患者，共获得2453株S. aureus。质量控制菌株S. aureus ATCC 25923由国家临床实验室购买。选择2020年从包头医学院第一附属医院分离的所有90株MRSA菌株，并随机选择90株来自同一医院的MSSA菌株作为对照。

仪器和试剂

细菌鉴定和药敏试验使用VITEK 2 Compact系统（bioMérieux，法国）或BD Phoenix-100系统（BD，加拿大）及相应试剂。MH琼脂、含5%脱纤维羊血的MH琼脂和哥伦比亚血琼脂平板由Autobio（郑州，中国）提供。抗菌药敏试验纸片购自Oxoid（英国）；青霉素、头孢西丁、利奈唑胺和万古霉素的E-test条带购自Autobio；LB肉汤购自Aobox（北京，中国）。

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物技术（北京，中国）。PCR试剂包括2× Taq PCR MasterMix（GreatOcean Biotech，北京，中国）、琼脂糖（Solarbio，北京，中国）、50× TAE缓冲液（Solarbio）、溴化乙锭染色液（10 mg/mL；Solarbio）和100 bp DNA标记（Solarbio）。

方法

S. aureus的培养和鉴定

将分离的细菌菌株划线接种于哥伦比亚血琼脂平板，35°C培养24小时。使用VITEK 2 Compact或BD Phoenix-100系统进行细菌鉴定。

抗生素药敏试验

使用VITEK 2 Compact或BD Phoenix-100系统进行抗生素药敏试验。对于这些系统未涵盖的抗生素，根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南，使用Kirby-Bauer纸片扩散法或E-test进行药敏试验。结果按照2023年CLSI标准进行解释。

MRSA的鉴定

根据CLSI标准，使用头孢西丁纸片扩散法进行MRSA鉴定。抑菌圈直径≥22 mm的菌株被分类为甲氧西林敏感，直径≤21 mm的菌株被分类为耐甲氧西林。通过PCR确认携带mecA基因的菌株。

细菌基因组DNA提取

将单个细菌菌落接种于5 mL LB肉汤中，37°C、150 rpm培养18小时。取3 mL细菌培养物，10,000 rpm（约11,500 ×g）离心1分钟。沉淀用120 μL溶葡萄球菌素（100 mg/mL）在37°C处理40分钟。具体操作遵循基因组DNA提取试剂盒的说明，提取的DNA分装储存于4°C备用。

MLST

根据MLST网站（www.mlst.net）分析七个管家基因（arcc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi和yqil）的DNA序列。按以下组成制备25 μL PCR混合物：2×TaqPCR MasterMix（12.5 μL）、DNA（1 μL）、上游引物（2 μL）、下游引物（2 μL）、ddH2O（7.5 μL），PCR循环条件设置为：第一步：预变性（95°C，5分钟，1个循环）；第二步：变性（95°C，30秒）、退火（55°C，33秒）、延伸（72°C，1分钟），35个循环；第三步：最终延伸（72°C，5分钟），1个循环。PCR产物送GreatOcean Biotech（北京，中国）进行双向测序。使用S. aureus MLST数据库（https://pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus）鉴定STs。

毒力基因的PCR检测

20种毒力基因的引物序列包括scn、chp、sak、coa、nuc、ebps、eno、cna、bbp、fnbB、clfa、clfb、seb、seh、tst、eta、pvl、LukED、hla和hld，如前所述。每种毒力基因的名称和功能见表1。毒力基因引物的序列见表2。按以下组成制备25 μL PCR混合物：2×TaqPCR MasterMix（12.5 μL）、DNA（1 μL）、上游引物（2 μL）、下游引物（2 μL）、ddH2O（7.5 μL），PCR循环条件见表3。

统计方法

使用WHONET 5.6和SPSS 26.0软件进行数据分析。分类数据以计数或百分比表示，并在显著性水平P<0.05下进行χ2检验。

结果

S. aureus和MRSA的分离

2018年至2020年，从包头11家CARSS成员医院共分离出24,297株细菌，包括2453株S. aureus，分离率为10.1%。这些分离株来自有咳嗽、发热等感染相关临床症状且外周血白细胞和/或中性粒细胞计数升高的患者。2018年至2020年，S. aureus的年分离率分别为11%、10.2%和8.9%。三年间，共鉴定出309株MRSA，分离率为12.6%。2018年至2020年，MRSA的年分离率分别为11.7%、13.7%和12.4%，2019年最高，2018年最低（表4）。从2019年到2020年，S. aureus分离率的下降具有统计学意义（P=0.004），表明S. aureus流行率显著下降。从2018年到2019年，MRSA的分离率显著增加（P=0.036）。

S. aureus感染和MRSA分离的标本类型

2453株S. aureus来自多种来源，其中大部分来自伤口分泌物（932，38.0%），其次是痰液（462，18.8%）、脓液（210，8.6%）和血液（164，6.7%）。不同标本类型的S. aureus分离率显示统计学显著差异（P<0.05）。MRSA的最高分离率在痰液中观察到（16.7%），最低在脓液中（8.6%）。MRSA分离率在标本类型间也存在显著差异（P<0.05）。结果见表5。

MRSA和MSSA对常见抗菌药物的耐药性

MRSA对青霉素、红霉素和克林霉素的耐药率均超过70%。MSSA对青霉素（90.1%）和红霉素（70.1%）表现出高耐药率。MRSA对青霉素、克林霉素、四环素和环丙沙星的耐药率显著高于MSSA（P<0.05）。未检测到对万古霉素、利奈唑胺或替考拉宁耐药的菌株（表6）。

不同标本类型中MRSA的抗生素耐药性

在所有标本类型中，MRSA对青霉素、红霉素和克林霉素的耐药率超过70%。对利福平的耐药率在各标本类型中均低于22%。环丙沙星耐药在血液标本分离的菌株中最高（43.8%），在脓液分离的菌株中最低（4.5%）。庆大霉素耐药在痰液分离的菌株中最高（32.5%），在分泌物分离的菌株中最低（18.7%）。MRSA对环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星和利福平的耐药率在不同标本类型间存在显著差异（P<0.05）。结果见表7。

MRSA的MLST

对90株MRSA菌株的MLST分析鉴定出8种STs。主要STs为ST59（54，60%）、ST398（11，12.2%）、ST239（7，7.8%）、ST22（7，7.8%）、ST25（5，5.6%）、ST5（2，2.2%）、ST188（2，2.2%）、ST7（2，2.2%）。

与不同感染类型相关的MRSA的MLST

将90株MRSA菌株的STs按感染类型分组时，ST59主要与手术感染相关（66.7%，36/54），其次是呼吸道感染（12.5%，7/54）和其他感染（12.5%，7/54）。ST59菌株主要来源于骨科手足踝手术、造口伤口门诊和创伤科。两株ST5菌株与呼吸道感染相关，而两株ST188菌株和两株ST7菌株与其他感染相关（表8）。

MRSA和MSSA中毒力基因的检测

在90株MRSA和90株MSSA菌株中检测的20种毒力基因中，所有菌株均携带hla、hld、nuc、clfa和clfb基因。超过90%的菌株携带sak、scn和coa基因，其中coa基因在MSSA菌株中的检出率为100%。仅12株菌株携带seh基因，7株携带bbp基因，4株携带tst基因，两株MRSA菌株携带eta基因。两株MRSA菌株各携带17种毒力基因，而五株MSSA菌株各携带14种毒力基因。fnbB基因在MSSA中的检出率（83%）显著高于MRSA（15%）（P<0.05）。ebps基因在MRSA和MSSA中的检出率均为6%（图1）。

不同类型S. aureus感染中毒力基因的检测

将180株S. aureus的毒力基因按感染类型分组。bbp、seh和LukED基因仅存在于手术和血流感染分离的菌株中，tst基因仅存在于手术和呼吸道感染分离的菌株中，eta基因仅在其他感染分离的菌株中检测到。chp基因在手术感染中的检出率（82%）高于血流感染（50%），P<0.05。PVL基因在血流感染中的检出率（50%）高于手术感染（18%），P<0.05。LukED基因在手术感染（45%）和血流感染（40%）中的检出率高于呼吸道感染（0%），P<0.05。见表9。

不同ST类型MRSA中毒力基因的检测

将90株MRSA菌株的毒力基因按ST类型分组。ebps、bbp和tst基因仅在ST59型中检测到，检出率分别为25%、4%和4%。ST398未检测到seh，seb检出率仅为20%。PVL基因在ST59型中的检出率为33%，在ST22型中的检出率为67%。ST59和ST398 MRSA至少携带10种毒力基因，而ST239 MRSA至少携带11种毒力基因。见表10。

讨论

S. aureus可在患者入院前后携带。作为人类和动物中常见的共生生物，它能够定植于鼻孔、腋窝、会阴、皮肤和许多其他身体部位。据估计，约15%的普通人群在前鼻孔中持续携带S. aureus。患者可能在入院时已是S. aureus携带者；此外，他们可在住院期间获得该细菌，特别是在接受手术干预或其他侵入性程序时。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）被广泛认为是一种主要的医院病原体，在全球范围内导致显著的发病率和死亡率。MRSA定植不仅增加了后续感染的风险，还有助于医疗相关传播。

中国抗菌药物耐药性监测系统（CARSS）成立于2005年，负责监测中国常见临床病原体对各种抗生素的敏感性和耐药率，并持续监测细菌耐药性的变化。内蒙古包头共有11家三级医院参与了CARSS。我们分析了2018年至2020年上传至CARSS的数据，包头共分离出2453株S. aureus，分离率为10.1%，显著低于2020年中国抗菌药物监测网络的32.9%。包头S. aureus的分离率从2018年的11%下降到2020年的8.9%，中国南部也是如此（9.9–9.5%），但中国西北地区则显著增加（3.7–9.7%）。2020年S. aureus分离率的下降可能与COVID-19大流行有关，导致住院和门诊病例减少，从而标本减少，特别是门诊患者。

亚洲MRSA的发病率远高于世界其他地区，亚洲的分离率在28%至70%之间。相比之下，爱尔兰和加拿大的MRSA平均分离率分别为2.2%和11.8%。在我们的研究中，2018年至2020年MRSA的分离率分别为11.7%、13.7%和12.4%，没有明显趋势，但低于团队2019年报告的结果。MRSA的平均分离率为12.6%，略高于加拿大，但显著低于亚洲（46.9%）和中国其他地区（31.6%）。该比率低于CARSS报告的国家平均水平，但接近内蒙古自治区的平均水平（CARSS 2020年全国抗菌药物耐药性监测报告，http://www.carss.cn/Report/Details?aId=808）。这些发现表明，包头S. aureus和MRSA的分离率相对较低。

在我们团队之前的研究中，仅对分离菌株进行了耐药性分析，未区分样本来源。在本研究中，进行了详细细分。本实验中的2453株S. aureus来自分泌物、痰液、脓液和血液。其中，伤口分泌物中金黄色葡萄球菌的比例为38.0%，高于其他标本类型（P<0.05），与He等人的结论一致。MRSA的最高分离率在痰液中观察到（16.7%），显著（P<0.05）高于血液（12.2%），后者是第二高分离率。这些结果表明手术操作是S. aureus感染的主要来源，在临床肺部和血流感染的诊断中应考虑MRSA，特别是严重的血流MRSA感染可能危及生命。

MRSA和MSSA的抗生素敏感性分析显示，MRSA对克林霉素的耐药率为73.1%，高于Weiner等人报告的结果（56.2%）和2020年CHINET细菌耐药性监测（58.6%）。MRSA对青霉素和克林霉素的耐药率高于MSSA。这些结果表明，尽管包头MRSA分离率低，但对某些抗生素的耐药率超过全国平均水平。因此，临床医生应谨慎使用抗生素，确保经验性治疗与当地监测数据一致，以指导适当选择抗菌药物。

MRSA对环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星和利福平的耐药率在不同标本类型间存在显著差异。值得注意的是，血液样本分离的MRSA对环丙沙星的耐药率最高，而脓液样本分离的MRSA耐药率最低。同样，庆大霉素耐药率在痰液分离的MRSA菌株中最高，在伤口分泌物分离的菌株中最低。这些变异反映了S. aureus在抗生素耐药性和毒力系统方面的异质性，这与宿主条件、治疗方案和感染严重程度密切相关。因此，临床治疗策略应根据标本类型和耐药谱量身定制，以避免抗菌药物过度使用，从而导致耐药菌株增殖。

在我们团队之前的研究中，仅进行了耐药性监测，未对分离的S. aureus进行分子流行病学和毒力机制研究。基于先前发现，我们团队开展了进一步研究。90株MRSA菌株的MLST分析鉴定出8种STs，包括ST59、ST398、ST239、ST22、ST25、ST5、ST188和ST7。其中，ST59是主要类型，占分离株的60.0%，与Cui等人的发现一致（63.7%）。ST59于2004年首次在台湾报道，此后演变为东亚最流行的STs之一。尽管ST59也在欧洲和北美报道，但在这些地区仍然不常见。在台湾，ST59占儿童CA-MRSA感染的56%，并且近70%的儿科CA-MRSA感染中观察到ST59相关败血症。此外，我们研究中66.7%的ST59感染与手术操作相关，主要是在骨科手足踝手术、造口伤口门诊和创伤科，表明皮肤和软组织仍然是ST59感染的主要部位。

S. aureus的毒力因子在发病机制中至关重要。与中国大陆的大多数研究一致，我们研究中几乎所有菌株都携带hla、hld、nuc、clfa和clfb基因，证实这些是S. aureus中最常见的毒力因子，表明其分布没有地区变异。超过90%的菌株携带sak、scn和coa基因。仅12株菌株携带seh基因，7株携带bbp基因，4株携带tst基因，两株MRSA菌株携带eta基因。检出率低于Li等人报告。两株MRSA菌株各携带17种毒力基因，而五株MSSA菌株各携带14种毒力基因。

fnbB基因在MSSA中的检出率（83%）显著高于MRSA（15%）。由fnbA和fnbB表达的纤连蛋白结合蛋白作为细胞信号和肌动蛋白细胞骨架重排的介质，并促进S. aureus侵入组织。fnbB基因经常在角膜炎、骨髓炎、医疗器械表面和骨科感染的菌株中检测到。在当前研究中，fnbB的检出率为49%，与Soltani等人报告的43.6%检出率一致，但高于血流感染研究中的29.5%检出率。这些发现表明fnbB在不同标本类型中的检出率存在异质性。与先前研究显示MRSA菌株比MSSA具有更高的生物膜产生和fnbA/fnbB表达相反，我们发现MSSA中fnbB检出率显著高于MRSA（P<0.05）。需要进一步研究以确定这种差异是否与MRSA基因组中生物膜相关基因和调控元件的可变表达有关。

当前研究中bbp基因的检出率仅为4%，与Kot等人的发现一致。先前研究表明，携带bbp基因的S. aureus菌株比其他生物膜相关基因的菌株具有更大的生物膜产生能力，尽管其低流行率限制了进一步研究。bbp基因编码一种对骨唾液蛋白具有高亲和力的蛋白质，并与血源性骨髓炎和关节炎相关。这些因素解释了本研究中的三名患者的检测，包括两名腰椎管狭窄症患者和一名急性骨髓炎患者。

Panton-Valentine杀白细胞素是临床感染中的内源性因子，对中性粒细胞产生显著的细胞毒性作用。由于报道的pvl基因阳性率在2%至35%之间，本研究中的29%阳性率接近上限。pvl表达增加提高了MRSA毒力，导致坏死性肺炎，死亡率高达75%。我们的研究发现，pvl的检出率在血流感染的S. aureus菌株中（50%）显著高于手术感染（18%）（P<0.05），表明pvl基因常与深部感染相关。此外，pvl基因在MRSA（33%）中的流行率略高于MSSA（25%）。早期研究表明pvl基因是MRSA鉴定的遗传标记。然而，Motamedi等人发现S. aureus中pvl和mecA之间没有显著关联，并且MSSA可能分泌相对高水平的毒素，特别是Panton-Valentine杀白细胞素。杀白细胞素ED通过形成寡聚孔样结构诱导中性粒细胞和淋巴细胞死亡。

chp、sak和scn基因是源自人类的S. aureus菌株特异且常见的。在我们的研究中，chp、sak和scn的流行率分别为79%、90%和94%，这支持了这一结论。此外，chp的检出率在手术感染的S. aureus菌株中（82%）显著高于血流感染（50%）（P<0.05）。

结论

本研究揭示了该地区S. aureus和MRSA独特的流行病学和分子特征。虽然分离率低于全国平均水平，但对关键抗生素的耐药率升高强调了量身定制抗菌药物管理的必要性。临床管理应考虑来源特异性耐药模式，特别是鉴于MRSA对大多数抗生素的较高耐药性及其在呼吸道标本中的优势。ST59谱系的主导地位——与高风险手术环境（骨科、创伤、伤口护理）中医疗相关的皮肤和软组织感染密切相关——要求在这些单元加强感染控制，包括严格的消毒协议、环境去污和术前MRSA筛查。

值得注意的是，分离株中毒力基因（hla、hld、nuc、clfa、clfb、sak、scn、coa）的近乎普遍携带表明其具有显著致病潜力，放大了严重手术部位感染或爆发的担忧。公共卫生工作必须优先监测这些高毒力菌株，特别是在脆弱的手术人群中。fnbB基因流行率在MSSA（83%）和MRSA（15%）之间的鲜明对比值得研究其在粘附或免疫逃避中的作用。未来研究应：（1）扩大区域监测以跟踪ST59传播和毒力基因分布；（2）将ST59感染与临床结果（如治疗失败、死亡率）相关联；（3）评估高风险手术人群中的靶向去定植协议以减轻ST59相关感染。

缩写

CA，社区获得性；CARSS，中国抗菌药物耐药性监测系统；CC，克隆复合体；CLSI，临床和实验室标准协会；CNA，胶原结合粘附素；HA，医院获得性；MLST，多位点序列分型；MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MSSA，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；PCR，聚合酶链反应；SAU，金黄色葡萄球菌；ST，序列类型。

伦理批准和参与同意

本研究遵循赫尔辛基宣言原则。批准由包头医学院第一附属医院、内蒙古科技大学伦理委员会授予（2025-1-20/K018-01）。数据匿名，因此放弃了知情同意要求。

作者贡献

所有作者对报告的工作做出了重大贡献，无论是在构思、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面，还是在所有