基于新型嗜热链球菌D4的生物技术平台：用于肠上皮细胞伤口修复的活性生物量与胞外多糖生产

这篇研究推荐：研究团队通过实验设计(DoE)优化培养基，开发了基于新型嗜热链球菌D4(S. thermophilus D4)的发酵工艺，显著提升生物量(7.5倍)和胞外多糖(EPS)产量(6倍)。创新性采用分批补料(fed-batch)策略突破乳酸抑制瓶颈，纯化的EPS在Caco-2细胞模型中展现显著促伤口愈合活性，为功能性食品和医药应用提供新方案。

　　

1 引言

嗜热链球菌(S. thermophilus)作为重要的乳品发酵剂，其产生的胞外多糖(EPS)兼具改善食品流变特性和生物活性功能。近期研究发现EPS具有抗氧化、抗肿瘤和促进肠道屏障修复等潜力，但传统M17培养基含动物源成分且产量有限。本研究从水牛乳清中分离的D4菌株出发，通过系统性生物工艺开发，建立高效生产平台。

2 实验方法

2.1 菌株与培养基

采用自主分离的D4菌株，以植物源中性大豆蛋白胨替代传统M17培养基的动物源成分。关键组分包括葡萄糖(20 g/L)、酵母提取物(15 g/L)和磷酸氢二钠(42.148 g/L)。

2.2 实验设计优化

通过两轮Plackett-Burman筛选：首轮14因素实验确定生物量关键影响因子（磷酸氢二钠效应值7.6，大豆蛋白胨5.2）；次轮5因素实验优化EPS生产，发现大豆蛋白胨浓度与EPS产量呈正相关（效应值4.34）。

2.3 发酵工艺

在2L生物反应器中对比分批与分批补料工艺：

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  补料策略：当葡萄糖浓度<1 g/L时，以8-10 g/L·h^-1指数补料

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  pH控制：通过NH₄OH/H₂SO₄自动维持pH7.0

2.4 下游纯化

采用超滤(10 kDa膜)、乙醇沉淀和脱盐色谱三步法，最终通过冻干获得高纯度EPS粉末。

3 关键结果

3.1 培养基优化

优化培养基使生物量(OD₆₀₀)达7.9，较M17提升4.9倍；EPS产量达1.81 g/L，提高13倍（表3）。

3.2 乳酸耐受模型

建立新型S型抑制方程（R²=0.99），确定菌株耐受极限为122 g/L乳酸（图4），为补料策略提供理论依据。

3.3 发酵工艺对比

分批补料工艺实现突破性指标：

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  生物量：10.7 g/L（较M17批次高7.5倍）

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  EPS：3.7 g/L（文献报道最高值的3倍）

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  乳酸产量：121.2 g/L，得率1.21 g/g（表4）

3.4 EPS特性

SEC-TDA分析显示主要组分分子量49.1 kDa（占37.4%），单糖组成为葡萄糖:半乳糖=1:0.4（图5）。

3.5 伤口愈合实验

0.1 mg/mL EPS处理使Caco-2细胞伤口闭合时间缩短60%：

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  80%愈合时间：14.4小时（对照37.7小时）

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  动态监测显示25小时近完全愈合（图6，表5）

4 创新价值

本研究首次揭示磷酸氢二钠对LAB生长的特殊促进作用，开发出完全植物源培养基。通过耦合DoE优化与动力学建模，建立的QbD（质量源于设计）框架为益生菌产业化提供范式。EPS的显著促愈合效果为肠道炎症治疗开辟新途径。

5 应用前景

该平台技术可延伸至：

① 功能性乳制品开发

② 医用敷料或肠道修复制剂

③ 高价值乳酸生产

后续研究将聚焦EPS分子机制解析和规模化工艺验证。