《Discover Medicine》：The role of Sonic Hedgehog (SHH) in the formation of motor neurons and neurodegenerative diseases
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本综述系统阐述了Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在人类胚胎干细胞（hESC）分化为运动神经元（MN）过程中的核心作用及其在肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病等神经退行性疾病中的新兴调控机制。文章深入探讨了SHH与视黄酸（RA）、Wnt等通路的协同与拮抗作用，并展望了基于SHH信号调控的再生医学治疗策略。
1 引言
运动神经元（MN）是中枢神经系统（CNS）中负责控制随意动作的关键细胞，其研究对于疾病建模和脊髓损伤修复具有重要意义。由于难以直接获取人体MN，大多数研究依赖于动物模型。利用人类胚胎干细胞（hESC）分化为MN已成为一种前景广阔的研究工具，其中，SHH和视黄酸（RA）作为关键的腹侧化和尾侧化因子，模拟了体内MN的分化过程。SHH信号不仅在早期发育中至关重要，还在成年脊髓和大脑中调节神经元身份维持和细胞应答。SHH信号的失调与多种神经退行性疾病密切相关。
1.1 运动神经元的形成
运动神经元的发育经历神经化、尾侧化和腹侧化三个阶段。在神经管形成过程中，骨形态发生蛋白（BMP）信号的抑制是神经诱导的关键。随后，沿头尾轴和背腹轴的模式形成由多种形态发生素梯度调控。RA是诱导脊髓神经元尾侧化的主要因子，而SHH则与BMP家族成员分别主导腹侧和背侧区域的模式形成。
1.1.1 SHH与RA在CNS和运动神经元形成中的相互作用
SHH信号通路和RA是中枢神经系统和运动神经元发育与分化的关键组成部分。在胚胎发育期间，SHH信号不仅促进神经管腹侧区域的细胞分裂和生长，还协调细胞的大小、形状和类型，特别是在端脑区域。SHH信号通路的中断可导致严重的神经缺陷。SHH与FGF-8的相互作用可诱导多巴胺神经元相关基因的表达。SHH通路始于SHH蛋白与其受体Patched-1（PTCH1）结合，解除对Smoothened（SMO）的抑制，进而调控Glioma-associated oncogene（GLI）转录因子的活性，这些机制对于神经发育至关重要。RA作为维生素A的代谢物，通过结合核受体调控基因表达，在神经祖细胞分化为特定神经元类型中发挥关键作用。研究表明，RA可以增强SHH靶基因的表达，并与SHH协同促进神经祖细胞向运动神经元的分化。Wichterle等人早在2002年就证明，将hESC暴露于RA和SHH可以将其分化为MN，这些MN表达NeuN、Lhx3、Isl1和Hb9等转录因子，并能够形成功能性突触。
1.2 运动神经元的特殊命运
神经管背腹轴的祖细胞被划分为p0、p1、p2、pMN和p3五个区域，分别产生V0-3中间神经元亚型和运动神经元。SHH从脊索和底板细胞分泌，通过影响同源域（HD）和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的表达来编程腹侧拓扑结构的发育。SHH下游的转录因子分为两类：在SHH影响下激活的II类蛋白（如Nkx6.1、Olig2、Nkx2.2）和表达被抑制的I类蛋白（如Pax6、Irx3、Dbx1、Dbx2）。I类和II类蛋白之间的对抗稳定了细胞命运并决定了区域边界。
pMN域内Olig2的表达增强了Ngn2的表达，这对于细胞周期退出和终末MN转录因子（如Hb9（Mnx1）、Isl1、Isl2和Lhx3）的诱导是必需的。
1.3 MN亚类的特化
尽管所有MN都起源于神经管腹侧，但其特定特征允许它们支配众多肌肉。MN可以根据其解剖和功能特征进行分类。沿头尾轴的位置由多种分子信号组织。高浓度的RA导致头侧区域（如颈部和臂部）MN的形成，而FGFs和Gdf11浓度的增加则导致尾侧区域（如胸部和腰部）MN的形成。Hox转录因子在整合RA、FGFs、Wnt和TGFβ家族成员信号以特化MN头尾轴亚型方面扮演重要角色。Hox蛋白表达的时空模式精确决定了MN亚群的特性。例如，Hoxc9的改变会导致小鼠胸段PGC和HMC MN的缺失以及臂部LMC域的发展。辅助因子如FoxP1和Nkx6.1进一步细化了这些身份。
1.4 来源于hESC的MN
在成功从小鼠hESC分化出运动神经元几年后，研究人员也实现了从人hESC分化MN，但后者过程更为复杂，需要更多的分化因子。通常，hESC先培养一周形成神经外胚层细胞玫瑰花结，然后用RA和Smo激动剂处理以诱导MN分化。为维持MN的存活和分化，还需使用BDNF、GDNF、CNTF和IGF-1等神经营养因子。由此获得的MN表达内源性MN特有的转录因子、受体和神经递质，功能相似。
1.5 SHH激活/失活的分子机制
SHH信号通路包括经典和非经典途径。经典通路包含PTCH1、SMO和GLI转录因子（GLI1、GLI2、GLI3）等关键组分。SHH配体与PTCH1结合后，解除对SMO的抑制，活化的SMO进入初级纤毛，阻止GLI蛋白被加工成截短的抑制因子形式（GliR），并促进其作为转录激活因子（GliA）发挥作用。这一过程高度依赖于初级纤毛。负调节因子如SuFu通过与GLI结合来抑制通路活性。此外，表观遗传调控，如PRC2复合物沉积抑制性组蛋白标记和KDM6B去甲基化酶移除这些标记，也精密控制着SHH靶基因的表达。
细胞视黄酸结合蛋白1（CRABP1）在MN分化中扮演重要角色，其表达受SHH-Gli1信号正向调控。在ALS和脊髓性肌萎缩症（SMA）等MN疾病中，常观察到CRABP1和SHH-Gli信号组分的下调，提示其可能与神经元损伤有关。
1.6 GLI转录因子的激活机制及其在MN分化和相关疾病中的意义
GLI转录因子（GLI1、GLI2、GLI3）是Hh信号通路的关键介质。SHH与PTCH1受体结合后，解除对SMO的抑制，活化的SMO易位至初级纤毛，启动下游信号级联，导致GLI蛋白磷酸化、稳定化并转入核内调控靶基因转录。在MN分化中，GLI蛋白调控Nkx2.2、Olig2和Isl1等关键转录因子的表达，对MN的特化和成熟至关重要。该通路的失调与基底细胞癌（BCC）、髓母细胞瘤等癌症以及ALS和SMA等神经退行性疾病相关。
1.7 SHH和Wnt协同参与神经元分化
SHH和Wnt信号在神经管发育中相互协作。SHH通过调控细胞周期蛋白Cyclin D1的表达影响细胞周期进程，而Cyclin D1本身也可能是Wnt/β-catenin通路的靶点。在胚胎神经管中，Wnt家族成员（如Wnt1、Wnt3a）主要在背侧表达，而SHH在腹侧表达。研究表明，SHH活性受Tcf3/4表达的影响，而Wnt/β-catenin信号可通过调控Gli3的表达来对抗SHH的图式形成活性。这些通路之间的复杂相互作用共同决定了神经管背腹轴神经元的命运。
1.9 TP53对SHH信号机制的作用
肿瘤蛋白p53（TP53）不仅在癌症中发挥作用，也参与干细胞分化。TP53通过调控初级纤毛的发生影响SHH信号。TP53失活或其靶基因BBS9的表达抑制会导致hESC中纤毛缺失，从而削弱SHH信号。TP53还通过负向调节因子PTCHD4来下调SHH信号，其表达减少可能导致SHH信号异常激活和神经管缺陷。
1.10 SHH信号与三碘甲状腺原氨酸（T3）在神经元分化中的相互作用
SHH和甲状腺激素（特别是T3）对大脑神经元的生长发育至关重要。T3缺乏会影响神经元的增殖、分化和迁移。研究表明，T3在成年大脑中影响SHH及其受体PTCH1、SMO的表达。SHH可能通过诱导T3的负调节因子——III型脱碘酶（DIO3）来影响T3信号。在干细胞向神经元分化过程中，激活T3通路或抑制SHH通路（而非完全缺失）可能是一种提高细胞存活率、降低恶性风险的有效策略。
1.11 SHH信号通路在CNS疾病中的作用
1.11.1 SHH信号通路在阿尔茨海默病（AD）中的作用
AD的特征是胆碱能神经元功能障碍和β淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑。研究表明，SHH信号可能参与神经元细胞周期调控，其信号减弱可能导致海马神经元凋亡，影响空间学习记忆能力。Aβ肽可通过作用于初级纤毛，破坏神经胶质祖细胞中的SHH信号（抑制Ptc1和Gli1）。SHH是基底前脑核团胆碱能神经元生长的重要诱导因子，但其信号过度激活也可能有害，例如蛋白酶nexin-1（PN-1）通过阻断SHH通路减少海马神经元凋亡，从而起到保护作用。SHH在AD中的角色具有双重性。
1.11.2 SHH信号通路在帕金森病中的作用
帕金森病以黑质致密部和纹状体多巴胺能神经元退变为特征。SHH能够保护中脑多巴胺能神经元免受MPP+等毒素的损伤。向帕金森病模型小鼠注射SHH-N可改善运动功能并增加纹状体酪氨酸羟化酶阳性神经元。SHH通路通过增强超氧化物歧化酶1（SOD1）的活性来对抗氧化应激。星形胶质细胞在氧化应激下可内源性分泌SHH，而外源性SHH则通过激活PI3K/Akt/Bcl-2通路保护星形胶质细胞。SHH与Wnt/β-catenin通路的相互作用在多巴胺能神经元分化中也至关重要。近年研究发现，中脑多巴胺神经元分泌的SHH信号对于维持成年大脑黑质纹状体环路的神经化学和结构稳态至关重要，其破坏会导致类似帕金森病的进行性神经元变性。此外，增强胆碱能中间神经元中的SMO信号可减轻左旋多巴诱导的异动症（LID）。单细胞转录组学分析还发现，散发性帕金森病患者神经前体细胞中初级纤毛相关基因表达改变导致纤毛缩短，并伴随SHH信号过度活跃，抑制SHH通路可挽救线粒体功能障碍。
1.11.3 SHH信号通路在肌萎缩侧索硬化（ALS）中的作用
ALS是一种影响上下运动神经元的进行性神经退行性疾病。SHH在维持血脑屏障完整性、对抗氧化应激等方面发挥直接作用。研究发现，运动神经元中细胞CRABP1的表达减少可能在MN破坏中起作用，而SHH可能通过GLI1上调CRABP1。另有研究指出，SHH信号可能通过影响脑脊液（CSF）的分泌和吸收，或通过与Notch等信号通路的相互作用参与ALS的病理过程。因此，调节SHH通路活性可能成为ALS的潜在治疗策略。
1.11.4 SHH信号在临床环境中的潜在风险
SHH信号通路在胚胎发育、组织稳态和修复中不可或缺，但其失调可导致严重的病理后果，尤其是肿瘤发生。异常激活与基底细胞 carcinoma（BCC）、髓母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和小细胞肺癌等多种癌症相关。主要机制包括PTCH功能丧失、SMO激活或GLI转录因子过度活化导致的细胞增殖失控。为降低治疗风险，需采取靶向递送、联合疗法、生物标志物监测等策略。
1.12 针对SHH通路的新兴基因编辑方法
CRISPR/Cas9等基因编辑技术的进步使得能够精确操纵SHH信号通路，用于发育研究和治疗干预。研究表明，利用CRISPR技术定向重编程人类诱导多能干细胞（iPSC）为运动神经元，可加速神经元分化并改变SHH介导的图式形成。高通量CRISPR筛选有助于系统解析SHH相关转录网络和表观遗传调控因子。从转化角度看，利用CRISPR激活构件上调SHH信号可能通过增加CRABP1表达来增强ALS模型中的神经元存活。虽然目前针对SHH的临床试验主要集中在肿瘤领域，但临床前模型提示激活SHH通路可能对ALS和帕金森病具有神经保护作用，将其整合到干细胞再生平台中是一个有前景的方向。
2 结论
本综述强调了SHH和RA信号在运动神经元和中枢神经系统分化发育中的关键作用。尽管利用hESC生成MN的技术已取得进展，但现有方案仍不足以产生多样化的MN亚型。文章详细探讨了SHH激活与失活的分子通路、表观遗传调控因子（如PRC2、KDM6B）、RNF220在神经元分化和髓母细胞瘤进展中的作用，以及CRABP1在MN疾病中的意义。SHH与Wnt、TP53、T3等因子的相互作用对于神经系统发育和疾病防治至关重要。同时，必须警惕SHH信号失调的致癌风险。未来研究将聚焦于利用单细胞RNA测序和CRISPR/Cas9基因编辑等先进技术，深入解析SHH与RA等通路的复杂相互作用，为神经系统疾病治疗开辟新途径。
