毛细管区带电泳-串联质谱联用技术定量分析阿尔茨海默病与健康大脑的蛋白质形态差异

这篇综述创新性地将毛细管区带电泳（CZE）与串联质谱（MS/MS）联用，首次实现了阿尔茨海默病（AD）与健康大脑的定量蛋白质形态组（TDP）分析。研究鉴定出3191种独特蛋白质形态，发现AD患者大脑中存在2200余种疾病特异性蛋白质形态，157种蛋白质形态在两组间存在显著丰度差异（p<0.05）。关键发现包括tau蛋白（MAPT）、神经颗粒素（NRGN）和钙调蛋白（CALM1）等蛋白质形态的双向调控现象，揭示了淀粉样纤维形成、微管细胞骨架紊乱等AD相关通路改变。

　　

ABSTRACT

阿尔茨海默病（AD）作为最常见的神经退行性疾病，其病理特征表现为认知功能衰退和异常蛋白聚集。研究通过毛细管区带电泳（CZE，液相离子淌度分离）与串联质谱（MS/MS）联用技术，对5例AD患者和5例健康对照的死后皮层样本进行定量蛋白质形态组（TDP）分析。结果显示，AD大脑中存在显著的蛋白质形态重构：仅23%的蛋白质形态（736/3191）在两组间重叠，157种蛋白质形态呈现统计学显著差异（p<0.05）。基因本体（GO）分析表明，差异蛋白质形态涉及端粒组织、黑质发育、淀粉样纤维形成等AD相关生物学过程。

材料与方法

样本制备：从密歇根AD研究中心（MADRC）队列获取颞下回皮层样本，经尿素裂解缓冲液提取蛋白后，采用10 kDa超滤离心管进行缓冲液置换。SEC分级：使用孔径500 ?的SEC柱将450 μg蛋白分为3个分子量级分（750 μL/级分）。CZE-MS/MS分析：采用线性聚丙烯酰胺涂层毛细管（50 μm内径），在5%乙酸（pH 2.4）背景下进行电泳分离，与Orbitrap Exploris 480质谱联用。数据依赖采集（DDA）模式下，选择5+至60+电荷态的离子进行HCD碎裂（25% NCE）。

结果与讨论

蛋白质形态特征：

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  组间差异：PCA分析显示AD组蛋白质形态异质性显著高于对照组（图2C）。典型差异蛋白质形态包括：

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    双向调控案例：钙调蛋白CALM1存在两种相反表达模式的蛋白质形态——含79 Da质量偏移（乙酰化+磷酸化）的形态在对照组高表达（p=0.008），而含25 Da偏移的形态在AD组富集（p=0.002）（图3C, 4A-B）。

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    tau蛋白变异体：鉴定到8种磷酸化tau（2N4R）蛋白质形态，其中327-369片段在对照组高表达（p=0.03），384-439片段在AD组显著升高（p=0.002）（图3D, 4C-D）。

病理相关发现：

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  淀粉样蛋白：Aβ₄₂和Aβ₄₀在AD组的丰度分别为对照组的54倍和182倍，但个体间变异达10倍（2E9 vs. ≤2E8），反映AD分子异质性。

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  神经颗粒素：NRGN的1-43片段（含乙酰化+甲基化）在AD组升高（p<0.01），而44-78片段在对照组富集（图3E, 4E-F），提示钙信号通路紊乱。

通路分析：

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  AD特异性通路：上调蛋白质形态关联淀粉样纤维形成（含cystatin-B、α-synuclein等）、微管组织（图S9A）。

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  对照组富集通路：轴突发生（含NEFL、SNAP25）、突触可塑性相关通路（图S9C）。

结论

这项研究首次建立SEC-CZE-MS/MS技术平台用于AD蛋白质形态组分析，揭示了疾病特异的蛋白质形态重构规律。发现的双向调控蛋白质形态（如CALM1、MAPT）和条件特异性tau变异体，为AD的早期诊断提供了新型分子标记物。未来扩大样本量将有助于验证这些发现。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如HCD（高能碰撞解离）、NCE（归一化碰撞能量）等均保留英文缩写；上标/下标使用标签规范表示）