基于腺病毒载体的生物制剂免疫原性体外评估新方法开发及其在传染病预防中的应用研究

本研究针对传染病预防中生物制剂免疫原性评估的难题，开发了结合2D/3D模型的体外评估平台。研究人员利用PBMC（外周血单个核细胞）和Calu-3（支气管上皮细胞）构建共培养体系，通过腺病毒载体AdV-D24-ICOSL-CD40L（AdV1）搭载SARS-CoV-2刺突蛋白（S-His）和核衣壳蛋白（N-His），揭示了CD4+ TCM/TEMRA亚群增殖、Rap1信号通路激活等关键免疫机制，为疫苗开发提供了高效安全的非临床评估工具。

　　

在传染病防控领域，如何快速评估疫苗候选物的免疫原性一直是科学界的重大挑战。传统动物模型存在伦理限制和种属差异，而现有体外模型难以模拟复杂免疫反应。Joanna Baran团队在《Immunologic Research》发表的研究，通过创新性整合腺病毒载体技术与3D培养系统，为这一难题提供了突破性解决方案。

研究采用健康供体外周血单个核细胞（PBMC）与支气管上皮细胞（Calu-3）构建2D/3D共培养模型，结合流式细胞术、RNA测序和细胞因子检测等技术。重点评估了携带ICOSL（可诱导共刺激分子配体）和CD40L（CD40配体）的腺病毒载体AdV1与SARS-CoV-2抗原（S-His/N-His）的组合效应，并通过小鼠实验验证安全性。

T淋巴细胞亚群响应

24小时刺激即观察到CD4⁺ T_CM（中央记忆T细胞）和CD4⁺ T_EMRA（终末分化效应记忆T细胞）显著增加（图1）。7天培养后，AdV1单独处理使CD4⁺细胞比例提升至56.00±0.26%，而CD8⁺细胞下降至37.93±0.35%（图3A）。值得注意的是，AdV1+S-His+N-His组合显著降低CD8⁺ T_EMRA比例至2.97±0.23%（图3C），同时促进初始T细胞（T_NAIVE）和干细胞样记忆T细胞（T_SCM）扩增（图3D）。

PBMC与Calu-3转录组分析

RNA测序发现AdV1+S+N处理组PBMC中Rap1信号通路相关基因（如FGFR4、PLCE1等）显著差异表达（表3）。FGFR4（成纤维细胞生长因子受体4）下调可能通过mTORC1通路影响免疫细胞增殖（图4）。Calu-3细胞则显示IL-10产生相关基因激活（图5），与后续细胞因子检测结果相互印证。

3D模型验证

电镜显示Calu-3细胞在Transwell膜上形成微绒毛结构（图S11）。感染实验证实，AdV1+S+N预处理后，SARS-CoV-2 Delta和Omicron变异株攻击均能诱导CD8⁺ T_EMRA增至51.57±8.74%（图6C），表明模型可模拟呼吸道病毒感染免疫应答。

细胞因子谱特征

AdV1+S+N处理组IL-10、IL-12p70和IL-8显著升高（图7），其中IL-12p70（1700 pg/mL）与Th1型免疫应答相关。值得注意的是，所有AdV处理组均诱导IFN-γ分泌，而缺乏S-His的AdV1+N-His组合则特异性升高IL-6和IL-17F。

体内安全性验证

28天小鼠实验显示100%存活率（图8），器官形态学无异常（表S6）。AdV1+S+N组体重波动在生理范围内（图10），证实平台生物相容性。

这项研究开创性地建立了可模拟人体免疫应答的体外评估体系，揭示CD40L/ICOSL双修饰腺病毒载体通过调控Rap1-mTORC1-FGFR4轴增强免疫记忆的新机制。其3D模型成功整合了上皮-免疫细胞互作、多时间点检测和病原体攻击实验，为疫苗开发提供了标准化评估工具。特别值得注意的是，该平台能区分不同抗原（S-His/N-His）的免疫特性差异，这对设计广谱冠状病毒疫苗具有重要指导价值。研究提出的FGFR4下调与IL-10/IL-12p70平衡机制，也为理解免疫调节提供了新视角。