挖掘CD4抗原库开发下一代结核病mRNA-LNP疫苗：从表位筛选到三价疫苗的临床前验证

本研究针对结核病(TB)疫苗开发中抗原选择缺乏系统性的难题，通过建立小鼠体内筛选平台，从人类潜伏感染(IGRA+)的CD4 T细胞靶向抗原中鉴定出8个具有显著保护效力的新型抗原。研究发现PPE/Esx/PE家族抗原存在免疫交叉反应性，并开发出包含PPE20(Rv1387)、EsxG(Rv0287)和PE18(Rv1788)的三价mRNA-LNP疫苗，该疫苗在标准剂量和低剂量(1 MID50)攻毒模型中均能增强并超越BCG的保护效果，使感染率降低至26%(p=0.039)，双侧肺播散率降至0%(p=0.046)。研究还证实84%的结核暴露人群存在对这些抗原的细胞免疫应答，为临床转化奠定基础。

　　

结核病仍是全球传染病致死的主要原因，尽管卡介苗(BCG)已使用百年，但其对成人保护效力有限且加强接种无效。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)基因组编码约4000个开放阅读框，其中超过100个能被感染者的T细胞识别，但如何系统筛选保护性抗原仍是疫苗开发的瓶颈。传统策略多关注分泌蛋白如ESAT-6或Ag85B，而人类潜伏感染(LTB)人群的CD4 T细胞靶向抗原谱尚未被充分挖掘。更棘手的是，BCG疫苗接种在流行区覆盖率高达90%，新疫苗需在预存免疫背景下发挥作用。

研究团队建立了一套创新的筛选体系：首先利用CB6F1小鼠( BALB/c × C57BL/6杂交F1代)扩展MHC II类分子多样性，通过DNA疫苗平台系统评估42个抗原的保护效力。其中8个抗原显示≥2.5倍的细菌负荷降低，包括PPE20(Rv1387)、EsxG(Rv0287)等临床未验证靶点。关键发现是这些抗原按PPE/Esx/PE/Ag85家族形成四个进化簇，通过16-mer肽段去卷积证实各簇内存在共享CD4表位。研究人员进而开发mRNA-LNP递送系统，该平台相比DNA疫苗能诱导更高比例的polyfunctional CD4 T细胞(分泌IFN-γ⁺TNF⁺IL-2⁺三阳性细胞占比提升2.1倍，p<0.01)。

主要技术方法包括：1) 建立CB6F1小鼠模型进行DNA疫苗初筛；2) 采用Tamura-Nei遗传距离模型分析抗原系统发育；3) 开发包含ALC-0315脂质的mRNA-LNP递送系统(粒径70-100nm)；4) 低剂量(1 MID₅₀)气溶胶攻毒评估感染/播散率；5) 南非青少年队列(ACS)的PBMC ELISPOT验证人群应答率。

In vivo antigen screen

通过DNA疫苗初筛发现，临床在研抗原仅占高效抗原的25%(p=0.0024)，而新型抗原PPE20(Rv1387)等显示出4.1倍细菌负荷降低。流式细胞术证实这些抗原能诱导多功能CD4 Th1应答，但免疫原性并非保护效力的充分条件。

Phylogenetic and epitope analyses

系统发育分析揭示PPE20与EsxG等分属不同进化枝，但各枝内抗原存在交叉反应。如PPE家族抗原在C端含有共享表位区域(第281-296位氨基酸)，这解释了为何接种Rv1387的小鼠对Rv0280肽段也有反应。

Trivalent mRNA-LNP vaccine

三价疫苗(15μg剂量)使标准攻毒模型的细菌负荷降低63倍(BCG仅14倍，p=0.022)。在共接种策略中，该疫苗不干扰BCG对TB10.4(Rv0288)的应答，却能将肺部CD4⁺IFN-γ⁺细胞比例提升3.8倍(p<0.01)。

Cellular immune responses in humans

在南非IGRA⁺人群(n=95)中，三价疫苗抗原的总体识别率(84%)显著高于M72/AS01E疫苗抗原(70%，p=0.033)，且68%受试者能识别≥2个抗原。

这项研究开创性地将人类免疫学数据与动物保护效力筛选相结合，不仅发现PPE/Esx家族新型保护性抗原，更通过mRNA-LNP平台克服了传统亚单位疫苗的局限性。特别值得注意的是，在模拟自然感染的低剂量(0.3 MID₅₀)重复攻毒模型中，疫苗将复合感染终点(感染+播散)从BCG组的50%降至23%(p=0.019)，这为评估疫苗阻断传播的能力提供了新范式。研究还揭示抗原的免疫优势与其系统发育位置相关，这为未来理性设计多价疫苗提供了理论框架。鉴于84%的结核暴露人群已存在对这些抗原的T细胞记忆，该疫苗策略可能更容易在人体诱导回忆应答，目前团队正推动该疫苗进入I期临床试验。